新型电洗脱装置—凝胶电泳联用分离制备蛋白质

作     者：陈静静 

作者单位：上海交通大学 

学位级别：硕士

导师姓名：樊柳荫

授予年度：2017年

学科分类：081704[工学-应用化学] 07[理学] 08[工学] 0817[工学-化学工程与技术] 070303[理学-有机化学] 0703[理学-化学] 

主      题：电洗脱 聚丙烯酰胺凝胶 制备型电泳 蛋白质 

摘      要：聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)是一种不可或缺的蛋白质定量和定性工具。其成本低、分辨率高、易操作,能分离制备多种生物分子,制备分离的生物分子可以用于多种下游应用,例如蛋白质化学、多肽检测、抗原检测等。如何从凝胶中回收蛋白质一直是科学家关注的问题,目前,从胶内回收蛋白质的方法大致可以分为三类:被动扩散、溶解胶、电洗脱。电洗脱的使用最为普遍,其原理为在电场力作用下,蛋白质从凝胶内迁移至周围溶液,该方法条件温和,不涉及苛性试剂。但是传统电洗脱法分离制备蛋白质仍然存在一些问题,例如操作复杂、耗时长、回收率低,以及洗脱所得蛋白质浓度过低,需要进一步浓缩才能用于下游应用。针对制备型凝胶电泳回收蛋白质存在的上述问题,本文设计了一款从凝胶中回收蛋白质的新型环形电洗脱装置,并应用于生物样品的分离制备。具体的研究内容包括:(1)环形电洗脱装置的设计及可行性验证。基于实验室之前的电洗脱装置,本文设计并通过Multiphysics软件和CNC精雕加工机自加工了新型环形电洗脱装置。该装置由两个部分组成:圆柱形的阴极槽和阳极槽,阴极槽包括环形的用于放置目标蛋白质凝胶条带和阴极的环形洗脱孔、用于回收目标蛋白质的中央富集孔,富集孔底部用半透膜封口。阳极槽为中空实底的圆柱体,用于放置阳极和洗脱缓冲,阴极槽置于阳极槽上。在电场作用下,目标蛋白质从凝胶条带中迁移至洗脱缓冲液中,洗脱下来的蛋白质由于在洗脱缓冲液中带负电荷,会在电场作用下继续向阳极迁移,从而迁移至富集孔,完成电洗脱。最后用模型蛋白质对新设计的环形电洗脱装置进行了性能评价,并于传统电洗脱装置进行了比较,结果显示新设计的环形电洗脱装置洗脱具有洗脱时间短、蛋白质浓度高、回收率高、操作简单、可重复使用等优点。(2)环形电洗脱装置与制备型SDS-PAGE联用,从血清中分离制备HSA。为了验证所设计的环形电洗脱装置从实际样本中分离纯化目标蛋白质的可行性,本部分以人血清为样本,通过从血清中分离纯化人血清白蛋白质(HSA)来考察新设计的环形电洗脱装置的性能。首先优化了环形电洗脱装置洗脱条件,包括电压、电泳洗脱时间。在优化的条件下(洗脱时间为30 min,洗脱电压为200 V),成功从复杂样品血清中分离制备出高浓度的HSA,验证了环形电洗脱装置与SDS-PAGE联用根据分子量大小分离制备蛋白质的能力。(3)环形电洗脱装置与制备型IPG-IEF-PAGE联用,从糖尿病人血液中分离制备糖尿病分子标记物糖化血红蛋白质。本部分先探索IPG-IEF-PAGE分离糖化血红蛋白质的条件:IPG-IEF-PAGE的pH范围为6–9、电泳过程的电压和时间。然后成功从病人糖尿病人血液中分离制备糖化血红蛋白质,经SDS-PAGE和HPLC分析其纯度高达95.48%,验证了环形电洗脱装置与IPG-IEF-PAGE联用等电点不同从复杂样品中分离制备生物标志物的能力。