毕赤酵母鼠李糖诱导型启动子PLRA3特征解析及改良

作     者：梁明丽 

作者单位：中国农业科学院 

学位级别：硕士

导师姓名：张伟

授予年度：2019年

学科分类：0710[理学-生物学] 07[理学] 08[工学] 09[农学] 071007[理学-遗传学] 0901[农学-作物学] 0836[工学-生物工程] 090102[农学-作物遗传育种] 

主      题：毕赤酵母 鼠李糖诱导型启动子PLRA3 转录调控 顺式作用元件 启动子改良 

摘      要：毕赤酵母表达系统是目前应用最广泛的真核表达系统之一,组成型启动子P和甲醇诱导型启动子P均能实现大多数外源蛋白的高效表达。然而,这两个启动子在调控重组蛋白表达时存在明显缺陷,如应用P时发酵过程不能精准调节,无法适用于毒性蛋白的表达;应用P时需要以有毒易燃的甲醇为诱导剂,不适于医药食品相关重组蛋白的表达。因而,亟待开发新型启动子应用于毕赤酵母表达系统。实验室前期研究了Pichia pastoris鼠李糖代谢途径相关基因LRA1-LRA4及调控基因rhaR,发现LRA3基因的启动子P可实现重组蛋白在毕赤酵母中的高效表达,有望将其应用于毕赤酵母表达的工业生产中,但对P尚未进行深入研究。本文首先通过基因敲除和回补实验证实了rhaR参与毕赤酵母鼠李糖代谢;EMSA实验结果表明rhaR编码的蛋白RhaR可结合于P,并揭示了其结合位点;通过CRRT-PCR方法揭示了P的转录起始位点,应用生物信息学分析预测了P关键的顺式元件;通过随机突变筛选到转录活性显著提高的P突变体。主要研究内容及结果如下:1.应用毕赤酵母基因无痕删除系统构建了rhaR无痕删除菌株*** GS115/ΔrhaR,回补rhaR构建了回补菌株*** GS115/rhaRC。实验结果表明,*** GS115/ΔrhaR不能在以鼠李糖为唯一碳源的培养基正常生长,*** GS115/rhaRC则恢复生长,证实了rhaR参与了毕赤酵母鼠李糖代谢。2.分析RhaR保守功能域,发现其含有Zn(II)Cys结构域,将此结构域与GST标签在大肠杆菌中融合表达并纯化。凝胶阻滞实验(EMSA)确认RhaR可与P结合,足迹试验(DNaseⅠfootprinting)揭示结合位点为5′-TAAACTGAAA-3′。以上结果表明RhaR通过结合P特定位点进而调控LRA3表达。3.通过CR-RT-PCR方法确定了P转录起始位点位于翻译起始位点上游22bp位置,为序列5′-TACCCCAGA-3′的第2个A。同时预测了其核心启动子、基础转录作用元件TATA盒及可能的顺式作用元件揭示了P的序列特征。4.通过易错PCR构建P随机突变体库,以乳糖酶LacB为报告基因进行高通量筛选,获得两个转录活性提高25%的突变体。