人乳头瘤病毒（HPV）16型单克隆抗体的性质鉴定及其在疫苗质量分析中的应用

作     者：张彩 

作者单位：厦门大学 

学位级别：硕士

导师姓名：李少伟

授予年度：2018年

学科分类：1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 100102[医学-免疫学] 10[医学] 

主      题：HPV16重组病毒样颗粒 多表位 疫苗质量分析 

摘      要：人乳头瘤病毒(Human papillomavirus,HPV)是已确证可导致人类癌症的病原体,持续感染HPV16等高危亚型会引起宫颈癌、口腔癌、直肠癌等癌症的发生。HPV16的主要衣壳蛋白L1可在体外自组装成为病毒样颗粒(Virus-like particle,VLP),VLP高度模拟天然病毒的表面结构,具备刺激机体产生免疫反应的能力,且因不含有病毒核酸而具备良好的安全性。因此,开发基于HPV16L1 VLP的疫苗具有极大的潜力和应用价值。目前,已上市的预防性HPV疫苗有三种,有效降低了 HPV病毒的感染和宫颈癌等癌症的发生,疫苗抗原刺激机体产生的中和抗体被认为是预防性疫苗的主要作用机制。疫苗的安全性和有效性是保证疫苗发挥保护作用的前提条件,因此,建立针对疫苗的质量分析方法对疫苗的研发、生产及免疫效果评估等具有重要意义。本研究旨在建立HPV16VLP疫苗的多表位免疫化学质量分析体系,利用多个识别抗原不同表位的单克隆抗体从多角度全方面的对疫苗抗原进行监控,为HPV16 VLP疫苗的生命周期管理提供科学依据和保证,也为其他VLP疫苗质量分析体系的建立提供思路。首先,对HPV16L1VLP的鼠源单克隆细胞株进行了生产,经过纯化后共获得27株单克隆抗体,并对这些抗体的型别特异性、抗体亚类、与抗原的结合能力、对抗原构象变化的敏感性及假病毒中和活性等性质进行了分析和鉴定。其次,在对各单抗的性质有一定了解的基础上,筛选出10株代表性单抗进行单抗相互阻断及人血清阻断实验,并通过SPSS分析软件对单抗的相互阻断信息及与人血清阻断的信息进行聚类分析,将单抗依据不同的结合表位区分为了 5类。然后综合考虑单抗的性质鉴定信息,从5个表位区内进一步筛选出6株可能识别不同免疫优势表位的单抗用于HPV16疫苗的免疫化学质量分析。将上述筛选出的单抗用于构建基于无分子标记的表面等离子法(SPR法),基于抗原“溶液中竞争的ELISA法(rIC50法)以及基于双表位检测的双抗夹心ELISA法(rECso法)。通过对各实验的实验条件进行摸索优化并对实验的灵敏度和有效性进行考察,最终建立了基于6株单抗的SPR法、基于5株单抗的rIC50法和基于2株单抗的rEC50法,经验证,基于各单抗建立的三种质量分析方法均具有良好的重现性和稳健性。最后,本研究应用建立的免疫化学质量分析方法对本实验室与厦门万泰沧海生物技术有限公司联合研制的HPV16VLP疫苗的免疫效果进行了评价并对疫苗生产工艺的改变进行了可比性分析。研究中,考察了疫苗抗原的发酵规模从100 L放大至500 L后的疫苗抗原性的变化情况。通过建立的SPR法和rIC50法对放大前后的疫苗抗原进行分析,发现发酵规模放大后的疫苗批次与对照疫苗的一致性良好,疫苗的免疫原性未发生明显变化。综上所述,本研究获得了针对HPV16L1VLP的单克隆抗体盘,通过对单抗各项性质的分析鉴定和对单抗表位识别区的聚类分析,最终筛选出了代表性单抗作为疫苗抗原定量分析工具,建立了 HPV16VLP疫苗的多表位免疫化学质量分析体系,并将建立的疫苗质量分析方法应用于HPV16 VLP疫苗的免疫效果评价及生产工艺的可比性分析研究中。这种多表位正交非重叠的免疫化学质量分析系统的建立,为HPV16疫苗的安全性和有效性提供了保障,为疫苗的体外相对效价评估奠定了基础,也为其它VLP疫苗的质量分析系统的建立提供了借鉴模式。