肢带型肌营养不良1B型LMNA基因新剪接突变致病性研究

作     者：余欣秀 

作者单位：广西医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：蓝丹

授予年度：2019年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100204[医学-神经病学] 10[医学] 

主      题：肢带型肌营养不良1B型 LMNA基因 剪接突变 新突变 致病性 

摘      要：目的本研究通过对一个疑诊肢带型肌营养不良1B型患者的临床表现、病理活检、致病基因检测等研究,检索数据库判断其致病性,运用生物信息学软件预测新突变对mRNA剪接的影响,最后通过实验方法从mRNA水平和蛋白水平证实其新突变的致病性并初步探索了发病机制,为肢带型肌营养不良的临床诊断和遗传咨询提供帮助。方法1.收集一个疑诊肢带型肌营养不良1B型患者临床病史资料、心肌酶谱等血生化检查、肌电图、心脏彩超结果。2.结合临床特点进行肌病包(myopathy panel,MP)二代测序(next-generation sequencing,NGS)。3.应用Sanger测序对可疑致病性突变位点进行验证,分析是否存在家系共分离,绘制遗传家系图谱;检索NCBI dbSNP数据库、Genome l000数据库过滤掉多态性位点;检索致病突变数据库The Human Gene Mutation Database(HGMD)和NHLBI Exome Sequencing Project(ESP)明确突变是否为新突变;应用生物信息学软件预测突变对mRNA剪接的影响,以及可能的致病机理。4.患儿行肌肉活检,取腓肠肌组织行苏木素—伊红(hematoxylin eosin,HE)及免疫组织化学(immunohistochemistry,IHC)染色,了解肌肉病理及相关蛋白质表达情况。5.设计实验验证生物信息学的理论推测,提取患儿腓肠肌总RNA行转录组测序,了解突变对mRNA剪接的影响。活检取患儿皮肤组织行原代成纤维细胞培养,Lamin A蛋白免疫组织化学(IHC)染色,了解患儿皮肤成纤维细胞Lamin A蛋白的表达情况。患儿及正常对照皮肤成纤维细胞cDNA行RT-PCR,观察患儿与正常对照LMNA基因mRNA表达量的差异。结果1.患儿行走乏力2年,呈进行性加重,步态呈鸭步,爬楼、起蹲困难,上肢肌力4级,下肢肌力4-级,Gower征(+),肌酸激酶(creatine kinase,CK)轻度升高为779 U/L;肌电图未提示肌源性损害;心脏彩超未见异常。2.肌病panel二代测序发现该患儿LMNA基因存在c.810+2TC剪接杂合突变。***测序验证检测结果并证实其父母未携带该突变。NCBI dbSNP数据库、Genome l000数据库均显示该突变在正常人群中发生频率极低,不属于多态性改变。HGMD和ESP致病突变数据库均无该突变致病性报道,为新突变。GERP++RS预测该突变位点具有高度保守性,Human Splicer Finder和NetGene2预测该突变发生mRNA剪接改变。***染色示肌纤维大小不等,肌细胞核数量明显增加,伴结缔组织增生,轻度肌营养不良表现;腓肠肌免疫组化结果示Lamin A蛋白表达正常。5.转录组测序结果示患儿肌肉mRNA存在两种序列,一种为正常序列,占92.2%;另一种为部分4号内含子保留,占7.8%。皮肤原代成纤维细胞呈梭形,胞体狭长,胞浆丰富。免疫组化结果示Lamin A蛋白在患儿皮肤成纤维细胞中表达缺失。皮肤成纤维细胞cDNA行RT-PCR结果示患儿LMNA基因中mRNA表达量较正常对照明显减少。结论1.首次报道LMNA基因c.810+2TC剪接杂合突变为LGMD1B的致病性突变。***基因c.810+2TC剪接杂合突变的致病机理为突变导致替代性的剪接供体位点激活,形成异常剪接变体,进而形成截短蛋白。3.在研究剪接位点突变对mRNA剪接的影响时,转录组测序简单、有效,同时能确定异常剪接变体的比例。