湿热应激对ETEC诱导腹泻小鼠HSPs介导TLR4信号通路的影响及三仁汤干预作用
作者单位：厦门大学
学位级别：硕士
导师姓名：赖鹏华
授予年度：2017年
学科分类：1008[医学-中药学(可授医学、理学学位)] 1006[医学-中西医结合] 100602[医学-中西医结合临床] 10[医学]
摘 要：旅行者腹泻(Travelers’ Diarrhea,TD)作为感染性腹泻病中的一种特殊类型,具有与地区、时间密切相关的流行病学特征。首先,TD发生与旅游目的地密切相关,Dupont[1]根据旅行者腹泻发生率的高低,将全球分为三类地区,南亚、非洲、拉丁美洲大多数的国家属高风险地区。其次,旅行者来源地亦影响TD发病率,即若旅行者来源地与目的地气候社会生活条件相仿,则TD发生率较低。且TD经常发生于逗留在外埠的早期阶段,停留时间越长,发生率和复发率越低。同样,若近期到过热带地区则再次到访时TD的发生率亦降低。专家推测这种现象与机体的应激和习服相关。TD的病因有多种多样,但以生物性致病因子最为重要,其中主要病种以产肠毒素性大肠杆菌(ETEC)为主,约占40%[2]。脂多糖(LPS)是大肠杆菌细胞壁最外层的主要物质,Toll样受体(TLRs)是近年来发现的在宿主抗病原微生物的免疫应答中起重要作用的细胞表面受体,也是巨噬细胞参与炎症反应的重要受体,在免疫防御中起关键作用。Toll样受体4(TLR4)可接受LPS的刺激,从而导致单核-巨噬细胞活化,使其吞噬和杀菌能力增强,同时释放一系列细胞因子而引起炎症反应。髓样分化因子88(MyD88)在TLR信号通路中属于节点位置,起着承上启下的作用,其传导的信号可以启动活化核转录因子-κB(NF-κB)信号通路,并在固有免疫防御、信号传递和疾病发生方面起着关键的作用。NF-κB是一种能调节炎症和免疫基因表达的转录调节因子,其可由细菌脂多糖、氧化应激、细胞因子等多种刺激激活,从而产生一系列的病理现象。热休克蛋白60(HSP60)、热休克蛋白70(HSP70)属于热应激蛋白,是生物体在抵制亚致死温度(一般高于其正常生长温度8～12℃)时体内合成的蛋白质。而对病原体的侵入,HSP60、HSP70会充当免疫抗原来激活免疫系统。因此,本实验通过观察湿热应激对ETEC感染性腹泻TLR4相关信号通路的影响探讨旅行者腹泻的发病机制及应激在其间的作用。“湿盛则濡泻,湿热为腹泻的主因,亦有流行病学调查显示旅行者腹泻在夏季、雨季发病率较高[1,2]。三仁汤出自吴鞠通的《温病条辨》,是湿热证通用方,作用于上、中、下三焦的湿热之证,临床可化裁治疗多种与湿热有关的病症。本实验还观察三仁汤对湿热应激下腹泻小鼠模型回肠组织HSPs及TLR4相关信号通路的影响以探讨发病机制和三仁汤的防治机制。目的:本实验采用复合因素(外部湿热应激和大肠杆菌ETEC感染)建立湿热应激下的腹泻小鼠模型,并观察在湿热应激下三仁汤对ETEC诱导的腹泻小鼠的行为学改变,TLR4、MyD88、HSP60、HSP70、NF-κB表达水平的变化,探讨湿热应激对TLR4胞内信号转导以及下游NF-κB信号转导的影响,及三仁汤的作用机理。方法:使用清洁级BABL/c小鼠140只,随机分组。通过高温高湿刺激、产毒性大肠杆菌腹腔注射,综合构建湿热证腹泻动物模型,给予三仁汤干预治疗,给予利福昔明作为阳性对照。用实时荧光定量PCR的生物学方法检测TLR4、MyD88、HSP60、HSP70、NF-κB的表达,HE染色法观察回肠病理改变。结果:1.湿热模型组出现发热、嗜卧、行动呆滞、肛周红肿、便塘或粘液便等表现;湿热模型鼠回肠组织HE染色见粘膜充血、水肿、渗出、淋巴组织增生、大量炎症细胞浸润,提示造模成功。三仁汤治疗组症状较轻,光镜显示肠道炎症反应明显减轻。三仁汤组和阳性对照组之间无明显差异。2.第6h湿热模型组回肠组织中TRL4、MyD88、NF-kB、HSP60、HSP70的信使RNA(mRNA)水平比正常对照组显著升高(p0.001,p0.001,p0.001,p0.01,p0.01)。三仁汤组第6h回肠组织中TRL4、NF-κB的mRNA水平比湿热模型组显著降低(p0.001,p0.01);TRL4的mRNA水平比阳性对照组显著降低(p0.01),三仁汤组和阳性对照组在其他指标上无明显差异。3.第18h湿热模型组回肠组织中TRL4、MyD88的mRNA水平比正常对照组升高(p0.05,p0.01,),NF-κB的mRNA水平比正常对照组降低(p0.05)。三仁汤组第18h回肠组织中NF-κB、HSP60的mRNA水平比湿热模型组升高(p0.001,p0.001);TRL4的mRNA水平比阳性对照组降低(p0.05),三仁汤组和阳性对照组在其他指标上无明显差异。结论:1.在大肠杆菌腹腔注射的基础上,使用人工智能气候箱创建高温高湿的环境,建立湿热证腹泻模型,体现了中医湿热证理论,脾胃内伤、再感客邪的“内外合邪的致病特点。2.湿热应激和大肠杆菌ETEC感染共同作用于小鼠,可引起前期(6h)小鼠回肠组织HSP60、HSP70的过度表达和TLR4水平的
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