靶向水稻BADH2和Bel基因的CRISPR/Cas9修饰及遗传转化

作     者：谢仕猛 

作者单位：海南大学 

学位级别：硕士

导师姓名：夏志辉

授予年度：2017年

学科分类：0710[理学-生物学] 07[理学] 09[农学] 071007[理学-遗传学] 0901[农学-作物学] 090102[农学-作物遗传育种] 

主      题：基因组编辑 CRISPR/Cas9 BADH2基因 Bel基因 水稻愈伤组织 转化 

摘      要：水稻供养世界一半以上的人口,是世界上最重要的粮食作物之一,也是我国南方的主要粮食作物。因此提高水稻的品质和种植效益对我国农业和经济发展具有重要的影响。同时随着人民生活品质的提升和消费的多元化,越来越多的人倾向于食用香米,如泰国香米、茉莉花香米。此外,杂交水稻是我国南方水稻的主要栽培品种,但在杂交稻种的生产过程由于不育系与恢复系的相间种植,容易影响杂交稻种的纯度及机械化水平,因此培育除草剂敏感的恢复系,将极大的降低杂交水稻种子生产的人工成本,提高杂交水稻生产的机械化水平。本文以苯达松敏感基因(Bel)和香味基因(BADH2)为研究对象,利用近几年出现的新型基因编辑技术CRISPR/Cas9定向修饰水稻的BADH2基因和Bel基因,经过农杆菌介导的Cas9系统转染水稻愈伤从而得到一系列的转基因植株,通过传统的PCR技术、限制性核酸酶酶切和测序等方法检测到一个或多个碱基的替换、插入。实验初步建立了 CRISPR/Cas9系统的靶向修饰体系和水稻遗传转化的过程。主要研究结果如下:(1)靶位点-Cas9重组表达载体的构建:利用生物信息学和基因工程等的技术手段在BADH2基因中选择了 3个靶标并分别构建了 pCAMBIA1301-fgr-sgRNAl-Cas9、pCAMBIA1301-fgr-sgRNA2-Cas-9、pCAMBIA1301-fgr-sgRNA3-Cas9 重组表达载体;同样地在Bel基因中选择了 1个靶标并构建pCAMBIA1301-ben-sgRNA1-Cas9重组表达载体。(2)农杆菌工程菌的构建:利用电击转化法将重组后的pCAMBIA1301-fgr-sgRNA1-Cas9、pCAMBIA1301-fgr-sgRNA2-Cas9、pCAMBIA 1301 -fgr-sgRNA3-Cas9 和pCAMBIA1301-ben-sgRNA1-Cas9质粒转化入农杆菌中,通过鉴定检测分别得到含有pCAMBIA1 301 -fgr-sgRNA 1 -Cas9、pCAMBIA 1301 -fgr-sgRNA2-Cas9、pCAMBIA1 301 -fgr-sgRNA3-Cas9、pCAMBIA1301-ben-sgRNA1-Cas9 这 4 个植物表达载体的农杆菌工程菌。(3)水稻转基因植株的获得:利用农杆菌介导的遗传转化法将重组农杆菌转化到TP309愈伤组织,经过筛选、诱导、分化发育后得到水稻幼苗植株。提取水稻DNA利用常规的PCR技术和电泳检测的方法检测到水稻各幼苗中分别存在有4株pCAMBIA1301-ben-sgRNA1-Cas9 的转基因水稻阳性植株、21 株 pCAMBIA1301-fgr-sgRNA1-Cas9的转基因水稻阳性植株、34株pCAMBIA1301-fgr-sgRNA2-Cas9的转基因水稻阳性转植株和29株pCAMBIA1301-fgr-sgRNA3-Cas9转基因阳性水稻植株。(4)靶位点突变检测:通过PCR技术、限制性核酸酶酶切和测序等方法对基因组中的靶位点序列进行分析鉴定发现,靶位点fgr-sgRNA2的34株中有9株发生了定点突变,靶位点突变率为26.5%;靶标fgr-sgRNA3中有9株发生突变,突变效率为31%;靶位点ben-sgRNA1有2株发生突变;而fgr-sgRNA1未有检测到有突变。靶位点fgr-sgRNA2主要发生碱基的替换;靶位点fgr-sgRNA3则以单碱基插入为主;靶位点ben-sgRNA1则发生插入和替换。从整体突变类型分析,插入突变约占一半的突变比重。(5)表型分析检测:分别利用KOH法和敏感性测定发现部分植株水稻叶片散发香味;在T1代ben-sgRNA1转基因植株中发现一株苯达松敏感植株。