咖啡酸衍生物的合成及其对蘑菇酪氨酸酶激活作用的研究

作     者：郑静 

作者单位：厦门大学 

学位级别：硕士

导师姓名：陈清西

授予年度：2017年

学科分类：07[理学] 070303[理学-有机化学] 0703[理学-化学] 

主      题：咖啡酸衍生物 化学合成 酪氨酸酶激活剂 

摘      要：酪氨酸酶广泛存在于各生物体内,其产物多巴醌能与氨基酸或者蛋白质聚合形成黑色素,是黑色素合成的关键酶。黑色素合成不足会引起白癜风等疾病及白发。因此,酪氨酸酶抑制剂和激活剂在制药及化妆品行业有重要开发价值。咖啡酸属于多羟基苯乙烯酸类化合物,具有多种生物活性,且对蘑菇酪氨酸酶的单酚酶和二酚酶活力具有激活作用,而吗啉类衍生物含有仲胺基团,具有仲胺基团的所有典型反应特征。本文以咖啡酸为母核与吗啉衍生物(4-(2-羟乙基)吗啉、4-(3-羟丙基)吗啉、2-氨乙基吗啉及N-氨丙基吗啉)反应,合成了 4种咖啡酸衍生物:咖啡酸-4-2-羟乙基吗啉酯(Z-1),咖啡酸-4-3-羟丙基吗啉酯(Z-2),咖啡酸-2-氨乙基吗啉胺(Z-3),咖啡酸-N-氨丙基吗啉胺(Z-4),以及咖啡酸本身形成内环的化合物Z-5。反应于二氯甲烷或三氯甲烷溶液中回流6 h,旋蒸,过硅胶柱,烘干得到粉末。再经LC-MS、红外光谱及1HNMR等鉴定其分子结构。以蘑菇酪氨酸酶为模型,对其进行活性筛选,结果表明5种衍生物均具有激活作用,其激活二酚酶的EC50分别为0.075,0.0375,0.06,0.1以及0.45 mmol/L。探究激活机理,发现Z-1和Z-2的双倒数直线相交于第二象限,属于非竞争性激活;Z-3和Z-4则相交于X轴的负半轴,属于混合型激活;Z-5则相交于Y轴,属于竞争性激活。酶学实验结果表明化合物具有很好的酪氨酸酶激活效果,其中,咖啡酸吗啉酯(包括Z-1和Z-2)对酪氨酸酶的激活效果明显强于咖啡酸吗啉胺类物质,说明咖啡酸衍生物对酪氨酸酶二酚酶的激活效应与分子结构有关。通过铜离子结合实验、荧光淬灭、分子对接实验研究激活剂分子与酪氨酸酶的作用机理。实验结果表明,激活剂可能与酪氨酸酶的活性中心氨基酸残基形成氢键,生成复合物,通过改变酶的构象从而影响酶的活力。Z-1、Z-2、Z-3、Z-4及Z-5对人正常的肝细胞L02及人的黑色素瘤细胞M14的增殖都没有抑制作用,这表明咖啡酸衍生物对细胞增殖没有影响,且对M14细胞中酪氨酸酶的表达均具有上调作用。综合实验结果表明合成的5种咖啡酸衍生物均是酪氨酸酶激活剂,在治疗白瘢风、少年白头等方面具有潜在的应用价值。