表皮生长因子和维甲酸复方柔性脂质体软膏的制备及烧伤愈合的研究

作     者：卢孔君 

作者单位：浙江大学 

学位级别：硕士

导师姓名：杜永忠

授予年度：2019年

学科分类：100702[医学-药剂学] 1007[医学-药学(可授医学、理学学位)] 1006[医学-中西医结合] 100602[医学-中西医结合临床] 10[医学] 

主      题：维甲酸 表皮生长因子 柔性脂质体 缓释 烧伤治疗 

摘      要：烧伤是最常见的创伤类型之一,主要治疗手段包括伤口清创、外用药物、敷料保护创面等,但深度烧伤治疗过程繁琐痛苦,且给患者带来了较大的经济负担。因此,开发新型局部外用制剂对治疗深度烧伤仍有重要意义。表皮生长因子(EGF)是临床上广泛应用的烧伤治疗药物,但其稳定性差,对于深度烧伤和大面积溃疡效果不佳。维甲酸是一种多功能外用药,能促进结缔组织新生,也用于治疗难愈性伤口。研究表明,维甲酸能提高表皮生长因子受体(EGFR)和肝素结合性表皮生长因子(HB-EGF)的表达水平,与EGF联用时能协同促进伤口愈合。因此,本论文分别制备了维甲酸柔性脂质体与EGF阳离子柔性脂质体,并进一步制备包含两种柔性脂质体的复方软膏,以期在烧伤治疗中发挥药物的协同作用,显著提高局部用药疗效,降低药物毒副作用,加快伤口愈合,提高伤口愈合质量。以卵磷脂为脂质体膜材,吐温80为膜软化剂,采用薄膜分散法制备不同膜软化剂含量的维甲酸柔性脂质体。研究结果表明:不同处方的维甲酸柔性脂质体粒径均在100 nm以下,包封率大于99%,载药量3%左右,药物可持续释放48小时以上;离体透皮与滞留的研究结果表明,与药物溶液相比,维甲酸柔性脂质体能显著提高药物的稳态透皮速率和皮肤内滞留量,具备良好的经皮渗透能力。其中,采用含20%吐温80处方制备的柔性脂质体粒径为48.10 nm,包封率99.84%,药物可持续释放48小时以上,与药物溶液相比,皮肤内药物滞留量提高了 2.92倍,将其制成软膏后仍具备良好透皮性能。以(2,3-二油酰基-丙基)-三甲胺(DOTAP)作为脂质体膜材,吐温80为膜软化剂,采用薄膜分散法制备空白阳离子柔性脂质体,再通过静电共孵育制备EGF阳离子柔性脂质体。研究结果表明:制得的EGF阳离子脂质体粒径仅16.00nm,包封率63.73%,药物可持续释放48小时以上;离体透皮与滞留的研究结果表明,与药物溶液相比,EGF阳离子柔性脂质体的皮肤内药物滞留量提高了 18.82倍,具备良好的经皮渗透能力,将其制成软膏后仍具备良好透皮性能。以人永生化表皮细胞系HaCaT为模型细胞,考察两种柔性脂质体的细胞毒性和促细胞增殖、迁移效果。细胞毒性结果表明:两种空白柔性脂质体的毒性较低,具有良好的生物相容性。细胞增殖研究结果表明:单用维甲酸柔性脂质体在低浓度下有一定促细胞增殖效果,单用EGF阳离子柔性脂质体有显著促增殖效果,且两种柔性脂质体联用显示出良好的协同作用。细胞迁移研究结果表明:单用维甲酸柔性脂质体对细胞迁移未有明显促进作用,单用EGF阳离子柔性脂质体有显著促细胞迁移作用,且两种脂质体联用时对细胞迁移有协同促进作用。制备包含两种柔性脂质体的复方软膏,体外释放的研究结果表明:药物可持续释放72小时以上,缓释效果良好。离体透皮与滞留的研究结果表明,复方脂质体软膏仍表现出较高的稳态透皮速率和皮肤内滞留量,具备良好的透皮性能。建立大鼠深二度烧伤模型,考察复方柔性脂质体软膏对深二度烧伤创面的治疗效果,并研究EGF与维甲酸联用产生协同作用的机制。结果表明:复方柔性脂质体软膏能显著加快深二度烧伤伤口表观愈合;HE和Masson染色组织切片显示复方柔性脂质体软膏促进了伤处皮肤附属器的生成,使皮肤恢复了一定功能;免疫组化染色表明复方柔性脂质体软膏提高了伤处增殖细胞核抗原(PCNA)、角蛋白6(Keratin6)的表达水平,从而促进伤口处的细胞增殖、迁移;复方柔性脂质体软膏还提高了伤处羟脯氨酸的合成,从而促进胶原的合成。此外,酶联免疫吸附分析(ELISA)结果表明维甲酸显著提高了伤处EGFR及HB-EGF等细胞因子的表达水平,以进一步增强EGF的促增殖作用,促进伤口快速愈合。综上所述,制备得到的两种柔性脂质体及复方柔性脂质体软膏能有效包载维甲酸和EGF并实现药物的缓释。复方柔性脂质体软膏能有效发挥EGF和维甲酸的协同作用,促进细胞的增殖、迁移,从而加快烧伤伤口的愈合,提高伤口愈合质量,有望成为一种治疗烧伤等创伤的高效安全新手段。