基于TMT标记联合液相色谱-串联质谱技术关于强直性脊柱炎的血清蛋白质组学研究
作者单位：天津医科大学
学位级别：硕士
导师姓名：夏群
授予年度：2018年
学科分类：1002[医学-临床医学] 100201[医学-内科学(含：心血管病、血液病、呼吸系病、消化系病、内分泌与代谢病、肾病、风湿病、传染病)] 10[医学]
摘 要：背景及目的:强直性脊柱炎(Ankylosing spondylitis,AS)作为自身免疫性的炎性疾病之一,具有慢性、进行性特点,其以肌腱和韧带附着点的慢性炎症为主要特征性病理改变。并且,AS可引起脊柱骨突、骶髂关节、肌腱端软组织、脊柱旁软组织及外周关节受侵,且同时合并关节外表现。临床及时诊断与治疗能够有效提高AS患者的预后效果,亦能够有效降低致残率,最终有助于促进患者的生活质量的提高。目前有关AS的发病原因尚未定论,既往研究认为其发病机制可能与遗传、免疫和感染等因素密切相关。本研究采用蛋白质组学的理念,通过串联质谱标签(Tandem mass tag,TMT)的方法,并采用液相色谱串联质谱进行分析,筛查并鉴定AS患者血清中具有的且较健康成人和弥漫性特发性骨肥厚症(diffuse idiopathic hyperostosis,DISH)患者的差异表达蛋白质,以期探索AS病理中存在的特异性差异蛋白,寻找早期诊断该病的血清蛋白标记物,同时为深入探讨AS的发病原因、探索临床早期诊断的方法与药物治疗靶点、并且为AS预后评估和易感人群的筛查等方面提供一定的依据。方法:1)参照ESSG(1991年)有关AS和ASAS(2009年)有关中轴型SPA(Spondyloarthritis,SPA)的诊断标准,采集6例AS患者、6例DISH患者(根据Resnick诊断标准)与6例年龄相近、性别匹配的正常人的空腹静脉血,于4℃下经低温离心处理,收集上层血清,并进行分装标识,将其置于-80℃环境下进行留存待测。将全部上层血清弃去高丰度蛋白,采取SDS-PAGE;接着采用蛋白胶内酶解,用胰蛋白酶(Trypsin)消化蛋白,获取肽段,通过TMT对其进行标记。其中,分为对照组(用TMT-127标记),AS组(用TMT-129标记),DISH组(用TMT-131标记)。肽段标记完毕后,进行充分混合,并进行除杂质除盐处理,最后液相色谱-串联质谱联用的检测分析则在纳升液相色谱仪与质谱仪上进行。根据SEQUEST HT检索算法,并在Swissprot Human数据库上进行谱图检索。搜库软件为Proteome Discoverer,通过Xcalibur 2.2版软件进行数据处理。肽段的相对定量则按照TMT不同试剂报告离子的相对丰度,同时依据结果计算蛋白的相对定量。若同一蛋白在某一组较其他组的比值(Ratio)变化超过1.5倍,即以Ratio1.5表示上调,Ratio0.75表示下调,此时具有显著差异。2)采用生物信息学的方法,初步分析所筛选和鉴定的全部差异蛋白,分析差异蛋白的作用机制,从而推断其在生物网络中的作用和关系,最终对认为具有意义的蛋白进行判定。结果:本实验共鉴定出蛋白质424个,其中达到相对定量标准的蛋白数为144个,采用两个及以上特有肽段进行定量的蛋白数61个,采用一个特有肽段进行定量的蛋白数为15个,相对健康对照组共有22个上调蛋白,42个下调蛋白;相对DISH组共有21个上调蛋白,24个下调蛋白。结论:1、本实验根据TMT标记蛋白定量技术,并进行液相色谱串联质谱分析,对AS患者血清相对于健康对照组与DISH组进行差异蛋白质组学研究,探究且建立AS患者血清TMT液相色谱串联质谱实验研究的技术框架。2、初步分析AS的特异血清标记物及其发病原因,由此设计患者血清差异蛋白质组的数据库,探索其血清中较健康群体和DISH患者出现明显改变的可定量蛋白。3、基于本实验,在蛋白质组学研究的同时,初步进行所筛出蛋白的生物信息学研究,试图找到一些潜在的AS的生物标记物,为深入研究提供一定基础。
同方学位论文库