具有漆酶活性菌株的筛选及其特性的研究

作     者：孙海琼 

作者单位：东北林业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：汪春蕾

授予年度：2018年

学科分类：0710[理学-生物学] 1007[医学-药学(可授医学、理学学位)] 100705[医学-微生物与生化药学] 07[理学] 071005[理学-微生物学] 10[医学] 

主      题：细菌筛选 漆酶特性 染料脱色 

摘      要：漆酶,是一种含铜的多酚氧化酶,能够氧化多种酚类及非酚类化合物,同时将分子氧还原为水。同植物及真菌漆酶比较,细菌漆酶具有不需要糖基化、热力学稳定性好及酶活最适pH广泛等优点,在造纸工业、废水处理、纺织工业、食品加工及生物传感器方面都有良好的应用前景。随着对细菌漆酶理论研究的不断深入,发现细菌漆酶能够有效地处理染料废水,且能够适应染料废水中染料品种多、杂和易变化等特点。因此,从细菌中寻找漆酶并使其广泛应用于生态环境具有十分重要的意义。本研究从土壤中筛选具有较高漆酶活性的细菌菌株,对细菌菌株的特性、细菌漆酶的相关酶学特性以及漆酶对染料的脱色效果和方式进行研究,为利用细菌漆酶处理染料废水提供新菌种和理论依据。主要研究成果如下:(1)具有漆酶活性菌株的筛选及鉴定利用铜离子作为筛选剂从土壤中分离到了 11株具有漆酶活性的菌株,通过丁香醛连氮定性检测,选取两株漆酶活性较高的菌株进行研究。通过细菌形态结构分析、生理生化特性以及16S rDNA序列分析,菌株HLS鉴定为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis),菌株 HL3 鉴定为芽孢杆菌(Bacillus sp.)。(2)菌株生物学特性分析菌株HLS及菌株HL3的最适生长温度均为37℃,最适生长pH为7.0;菌株HL3在含0-10%的NaCl的培养基中生长良好,对NaCl有较强的耐受性;菌株HLS在Cu2+浓度为0.4-1.0mmol/L的培养基中会形成白色粘状小球,且培养基呈现澄清状态,当Cu2+浓度为2.0mmol/L时,菌株又恢复正常生长状态。(3)菌株HL3芽孢漆酶酶学性质的研究选用漆酶活性较高的菌株HL3进行酶学性质分析。菌株HL3芽孢漆酶的活性为24.67U/g干重,其最适反应温度为80℃,最适反应pH为7.0。10mmol/L的NH4+、K+、Ba2+及Ca2+可以增强菌株HL3芽孢漆酶的活性,A13+、Fe2+和Mn2+明显减弱芽孢漆酶的活性,Cu2+抑制其漆酶的活性。0.1 mmol/L的L-半胱氨酸对芽孢漆酶的活性有一定的增强作用,浓度高于1.0mmol/L时,芽孢漆酶活性基本丧失。浓度低于1mmol/L的SDS和EDTA对芽孢漆酶的活性有一定的增强作用,浓度大于10mmol/L,开始对芽孢漆酶的活性有抑制作用。甲醇、乙醇、丙酮、乙腈及二甲基亚砜均抑制芽孢漆酶的活性。(4)菌株HL3芽孢漆酶对染料脱色的研究菌株HL3芽孢漆酶在无介体的脱色体系中,6h后对刚果红、结晶紫及靛红的脱色率均达到80%以上,而对活性亮蓝(RBBR)及活性黑5的脱色效果较差,脱色率只有50%左右;加入介体乙酰丁香酮(Ace)后,芽孢漆酶对活性黑5和靛红的脱色率都提高到90%以上,但介体Ace对RBBR、刚果红及结晶紫脱色率的影响不大。在脱色过程中,该芽孢漆酶对靛红的脱色主要为氧化作用,对其他四种染料的脱色主要为吸附作用。在添加一定量的芽孢漆酶时,随着不同染料初始浓度的增加,芽孢漆酶对染料的去除率逐渐下降;染料浓度一定时,随着酶用量的增加,芽孢漆酶对染料的去除率不断增大。菌株HLS小球能够使刚果红、结晶紫及酸性媒介红B脱色且可以重复脱色3次。