基于新型拉曼探针与先进性多巴胺芯片的胰腺癌外泌体快速微量检测的研制

作     者：李腾达 

作者单位：中国人民解放军海军军医大学 

学位级别：硕士

导师姓名：邓安梅;孔继烈;陈惠

授予年度：2018年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：胰腺癌 外泌体 表面增强拉曼散射光谱 MIF GPC-1 EGFR 

摘      要：第一部分PANC-1及HPDE6-C7细胞系外泌体的分离鉴定及特征性因子的检测本部分实验采用常规培养方法分别培养胰腺癌细胞系PANC-1和正常细胞系HPDE6-C7。外泌体分离采用超高速密度梯度离心法。分离得到的外泌体于透射电子显微镜(transmission electron microscope,TEM)下进行粒径和大小的观察。外泌体计数采用纳米分子追踪分析(Nanosight Tracking Analysis,NTA)技术,经计算五次实验得到均值作为其最终浓度。外泌体表面分子的鉴定采用磁珠捕获结合流式分析法和流式纳米分析法,蛋白定量采用BCA法,ZETA电位经Zetasizer Nano仪器测得。经实验,透射电镜结果显示,PANC-1与HPDE6-C7细胞系来源的外泌体(以下简称EXO-PANC1,EXO-HPDE6-C7)直径在30-180nm之间;NTA分析得到EXO-PANC1溶液的浓度为2.72*10±2.05*10个/ml,EXO-HPDE6-C7溶液的浓度为2.43*10±2.21*10个/ml;BCA法测定EXO-PANC1溶液的蛋白浓度为111.31μg/ml,EXO-HPDE6-C7溶液为109.89μg/ml;Zeta电位分析得到EXO-HPDE6-C7的ZETA电位为-25.4mV,EXO-PANC1为-10.1 mV。磁珠结合流式分析结果显示,CD9,CD63不能显著地将EXO-PANC1与EXO-HPDE6-C7区别开,而磷脂酰肌醇聚糖-1(Glypican-1,GPC-1)和巨噬细胞迁移抑制因子(macrophage migration inhibitory factor,MIF)可明显将两者区别开来,流式纳米分析结果显示EXO-PANC1表面高表达MIF与GPC1抗原。本部分结果证明PANC-1与HPDE6-C7得到的外泌体符合目前文献规定的相关特性(粒径大小,CD9,CD63分子的表达),在胰腺癌细胞系来源的外泌体中高标达的GPC1与MIF分子可作为后续实验检测的靶向分子。第二部分包被抗体的多巴胺芯片及SERS探针相关制备条件的摸索本部分实验中我们初步拟定了多巴胺芯片的制备步骤并探讨了多巴胺溶液浓度对芯片合成效果的影响。对用于表面增强拉曼散射(surface-enhanced raman scattering,SERS)技术检测的纳米探针的合成,我们首先采用经典途径合成18nm AuNPs作为核心,进而逐渐形成Au@Ag@pATP材料结构。为了保护较为脆弱的银层,我们在银表面添加了一层保护性牛血清白蛋白(albumin from bovine serum,BSA)。为将检测抗体连接到纳米颗粒表面同时不影响其稳定性和生物相容性,我们利用多巴胺的聚合作用将抗体黏附到纳米颗粒表面,从而形成了多层包被的纳米球SERS探针结构。我们对SERS探针的TEM镜下成像、紫外光谱、SERS光谱等特性进行了鉴定,并对探针合成过程中关键性影响因子-AgNO3溶液浓度及pATP溶液浓度进行了摸索。经实验,我们得知在多巴胺溶液浓度为33mM时芯片合成聚合效果最佳。SERS探针合成过程中AgNO3溶液为0.096mM,pATP溶液为9.6mM时效果最佳。TEM电镜下观察到Ag层的厚度为1nm左右,多巴胺为3nm左右,紫外可见吸收光谱观察到金纳米颗粒仅有一个吸收峰(521nm),而SERS探针有两个吸收峰(400nm与500nm),分别来源于银与金纳米颗粒。拉曼光谱显示SERS探针有较强的拉曼信号峰(1072-1076cm)。在低功率(0.05mW)和短扫描时间(10ms)的条件下,拉曼信号依旧可以获得。经本部分实验摸索得到的上述多巴胺芯片-SERS体系的优化条件将用于进一步实验体系的建立。第三部分多巴胺芯片-SERS检测系统用于细胞系外泌体的检测及其体系优化本部分实验我们分别以不同抗原为靶点,利用前期建立的多巴胺芯片-SERS体系对EXO-PANC1与EXO-HPDE6-C7进行了检测。结果表明以GPC1或MIF为靶点的多巴胺芯片-SERS检测体系能够将EXO-PANC1与EXO-HPDE6-C7进行区分,以CD9,CD63为检测位点不能有效地将两者区分。我们进一步加入表皮生长因子受体(Epidermal growth factor receptor,EGFR),对分别以MIF,GPC1,EGFR,CD63这四种抗原为靶点的多巴胺芯片-SERS体系的检测效能进行了评价,发现MIF/GPC1/EGFR组具有相同的最低检测限(9.0*10mol//L),而CD63组不能检测到该最低浓度下的外泌体。从各组得到的线性方程式来看,MIF组线性方程式的斜率最高,证明其检测灵敏度更高。接下来,我们以MIF为检测靶点对EXO-PA