大黄牡丹汤对溃疡性结肠炎小鼠及其肠道菌群的影响
作者单位：广州中医药大学
学位级别：硕士
导师姓名：周联
授予年度：2016年
学科分类：1008[医学-中药学(可授医学、理学学位)] 1006[医学-中西医结合] 100602[医学-中西医结合临床] 10[医学]
摘 要：目的:通过一般药效评价、对肠道菌群的影响等方面的研究,探讨大黄牡丹汤及其两种主要活性成分(大黄素、丹皮酚)对DSS诱导的溃疡性结肠炎(UC)的治疗作用。方法:1.大黄牡丹汤及其主要活性成分药效学评价。BALB/c小鼠分为正常组、模型组、柳氮磺胺吡啶组、大黄牡丹汤三个剂量组和大黄素三个剂量组。除正常组外,其余各组小鼠自由饮用3%DSS 6天建立UC模型,造模第1天开始分别灌胃给予大黄牡丹汤和大黄素10天。第11天取材,采用小鼠疾病活动指数(DAI)评价小鼠体重、粪便性状;结肠组织切片及HE染色观察小鼠结肠病变情况;2.大黄牡丹汤及其主要活性成分对免疫细胞的影响。流式细胞术检测UC小鼠肠系膜淋巴结中T、B淋巴细胞活化情况;MTT法检测脾淋巴细胞体外增殖的影响;3.大黄牡丹汤中有效单体抗消化液稳定性实验。紫外分光光度法测定大黄素和丹皮酚体外在人工唾液、模拟胃液中的稳定性;4.大黄牡丹汤及其主要活性成分对肠道菌群结构和多样性的影响。采用16SrDNA测序法测定肠道菌群的变化情况;5.大黄牡丹汤及其主要活性成分对与UC密切相关的三种肠道细菌的影响。平板计数法测定大黄牡丹汤、大黄素和丹皮酚体外对两歧双歧杆菌、脆弱拟杆菌和丁酸梭菌增殖的影响;荧光定量PCR法检测UC小鼠盲肠内容物中两歧双歧杆菌、脆弱拟杆菌和丁酸梭菌的含量;6.大黄牡丹汤及其主要活性成分对肠道菌群代谢产物的影响。气相色谱法检测整体肠道菌群、两歧双歧杆菌、脆弱拟杆菌和丁酸梭菌代谢产物——短链脂肪酸(SCFAs)分泌量的影响。结果:1.大黄牡丹汤及其主要活性成分对DSS所致UC小鼠的影响。BALB/c小鼠自由饮用3%DSS 6天可成功复制UC模型。除正常组外,其余各组小鼠体重、饮食量从造模第4天逐渐下降,大黄牡丹汤高剂量组小鼠体重在给药第8天后缓慢恢复;柳氮磺胺吡啶组、大黄牡丹汤各剂量组和大黄素各剂量组小鼠的饮水量、进食量于第8天后逐渐恢复。造模前5天,各组小鼠饮水情况相对稳定,饮水量从第6天开始下降,至第8天达到最低,而后逐渐上升。每天记录小鼠粪便性状和便血情况,并统计小鼠DAI,发现除正常组外,其余各组小鼠DAI自第4天明显升高,至第8天到达峰值,到第10天时,柳氮磺胺吡啶组、大黄牡丹汤中剂量组和大黄素各剂量组小鼠DAI均明显低于模型组。测量各组小鼠结直肠段长度发现,模型组小鼠结直肠水肿,明显变短,其余各给药组小鼠结直肠明显变长,且有一定的剂量依赖性。同时,取小鼠结肠进行HE染色,发现UC小鼠结肠粘膜层及粘膜下层病变严重,表现为杯状细胞大量坏死、脱落,隐窝消失,固有层肠腺明显缩小或消失,有大量炎症细胞浸润;粘膜下层间隙增大,血管扩张、充血,炎症细胞浸润;肌层明显增厚。给药后,柳氮磺胺吡啶、大黄牡丹汤和大黄素均能改善小鼠结肠炎症细胞浸润现象,肠壁变薄、粘膜层结构完整。2.大黄牡丹汤及其主要活性成分对免疫细胞的影响。观察小鼠肠系膜淋巴结中T、B淋巴细胞活化情况,发现UC小鼠T细胞活化增多,B细胞活化减少,但与正常组相比均无显著性差异。给药后,柳氮磺胺吡啶、大黄牡丹汤和大黄素均能降低肠系膜淋巴结中T、B细胞的活化程度,有一定的剂量依赖性(P0.05或0.01)。MTT法测定大黄牡丹汤和大黄素对脾淋巴细胞体外增殖的影响,结果表明,大黄牡丹汤和大黄素能剂量依赖性抑制由ConA及LPS所致的脾淋巴细胞体外增殖,结果与LPS组、ConA组相比有显著性差异(P0.05或0.001)。3.抗消化液稳定性实验结果表明,大黄素、丹皮酚在人工唾液、模拟胃液中可保持其吸光度的稳定。4.16SrDNA测序结果显示,体外分别给予大黄牡丹汤、大黄素和丹皮酚后,从门分类层面看,拟杆菌门细菌均减少,变形菌门细菌均增加,有剂量依赖性。而厚壁菌门细菌在大黄牡丹汤、大黄素体外作用下增加,而给予丹皮酚后减少;从属分类层面看,样品中含量较高的几种细菌在上述三种药物体外作用后,拟杆菌属细菌减少,乳酸杆菌属、乳球菌属增加。另外,埃希菌属、变形菌属在大黄牡丹汤、大黄素作用下有所增加,而给予丹皮酚后减少。但在对细菌种类的鉴定中,没有检测到两歧双歧杆菌、脆弱拟杆菌和丁酸梭菌,考虑是因为这三种细菌是严格厌氧菌,在体外提取、培养的过程中,因有氧气的存在,出现损失甚至死亡。5.平板计数法检测大黄牡丹汤、大黄素和丹皮酚体外分别对两歧双歧杆菌、脆弱拟杆菌和丁酸梭菌增殖的影响。结果显示:①大黄牡丹汤低浓度促进两歧双歧杆菌增殖,高浓度抑制;大黄素和丹皮酚均促进其增殖(P0.05,0.01或0.001)。②大黄牡丹汤、大黄素和丹皮酚剂量依赖性地抑制脆弱拟杆菌增殖(P0.01或0.001)。③大黄牡丹汤抑制丁酸梭菌增殖,而低浓度的大黄素和丹皮酚均促进其增殖,高浓度的大黄素和丹皮酚则抑制(P0.05,0.01或0.001)。荧光定量PCR法
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