基于弓形虫ROP18的重组耻垢分枝杆菌的构建及鉴定

作     者：梁大航 

作者单位：蚌埠医学院 

学位级别：硕士

导师姓名：方强

授予年度：2013年

学科分类：1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 100102[医学-免疫学] 10[医学] 

主      题：弓形虫 ROPO18 耻垢分枝杆菌 

摘      要：目的:(1)扩增弓形虫棒状体蛋白ROP18基因。(2)构建穿梭质粒pMV261-ROP18。(3)构建并鉴定表达弓形虫棒状体蛋白ROP18的重组耻垢分枝杆菌。方法:(1)将液氮保存的弓形虫RH虫株经过常规无菌复苏后注射到小鼠腹腔内,进行小鼠体内传代培养。连续三代传代培养后,收集弓形虫速殖子。(2)将部分收集的弓形虫速殖子悬浮于生理盐水中,反复冻融三次进行超声破碎,提取弓形虫速殖子蛋白。将弓形虫速殖子蛋白分别混以弗氏完全佐剂一次、弗氏不完全佐剂两次免疫小鼠三次。最后采集小鼠眼球血,获取小鼠抗弓形虫速殖子蛋白血清。(3)根据NCBI基因数据库中已知的弓形虫棒状体蛋白ROP18全基因序列,设计合成上下游引物。并且在引物基因序列前面引入HindⅢ和BamH Ⅰ限制性酶切位点。用飞捷生物公司提供的基因组DNA抽提试剂盒对收集的部分弓形虫速殖子进行弓形虫DNA抽提。用聚合酶链反应技术从弓形虫基因DNA内扩增出棒状体ROP18全基因序列。回收纯化的扩增产物与穿梭质粒PMV261分别经HindⅢ和BamH Ⅰ双酶切后以连接T4连接酶连接,构建pMV261-ROP18穿梭质粒,并转化到DH5α感受态细胞。在带有卡那霉素抗性的LB平板上挑选阳性克隆。进行单双酶切、菌液PCR及基因测序鉴定。(4)将重组pMV261-ROP18穿梭质粒经电穿孔方法转入到耻垢分枝杆菌内,构建耻垢分枝杆菌疫苗。(10)在带有卡那抗性的LB平板上挑选阳性克隆,经体外培养大量扩增。将扩增的耻垢分枝杆菌疫苗经热诱导后进行SDS蛋白电泳分析蛋白表达。以抗弓形虫速殖子蛋白血清为一抗热诱导后的重组耻垢分枝杆菌蛋白进行Wester-blotting鉴定。结果:成功复苏弓形虫RH虫株,并在小鼠体内获得大量的弓形虫速殖子。经基因组DNA抽提试剂盒获取大量弓形虫DNA基因。经冻融超声获得的弓形虫速殖子蛋白免疫小鼠后,眼球采血,获取抗弓形虫速殖子蛋白血清。PCR扩增产物凝胶电泳显示在约1665bp处见特异性条带。重组质粒pMV261-ROP18转化菌菌液经PCR检测显示约1665bp处见特异性条带;重组质粒pMV261-ROP18经经酶切电泳鉴定分别于约4500bp和1665bp处各见1条带;测序结果显示插入基因序列与弓形虫RH株ROP18编码基因序列一致。重组PMV261-ROP18穿梭质粒经电穿孔转化构建重组耻垢分枝杆菌,经热诱导后SDS-PAGE电泳分析和蛋白免疫印迹验证,分子量约为66KD处有外源性蛋白表达,且可为抗弓形虫速殖子小鼠血清识别,与预期相符,表明弓形虫棒状体蛋白ROP18蛋白在耻垢分枝杆菌中表达。结论:(1)成功扩增了弓形虫棒状体蛋白ROP18基因。(2)成功的构建了重组PMV261-ROP18穿梭质粒。(3)成功构建了 PMV261-ROP18重组耻垢分枝杆菌。