HTH家族成员OsHTH1在水稻花药发育中的功能研究

作     者：徐娅 

作者单位：华中农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：姚家玲

授予年度：2016年

学科分类：09[农学] 0901[农学-作物学] 

主      题：水稻 HOTHEAD 花药发育 角质 基因功能 

摘      要：植物地上部分器官的外表覆盖着角质层,具有防止植物表面非气孔的水分过度蒸发以及抵御病虫害侵入等功能,在增强植物对于外界环境的适应性、减少生物和非生物胁迫等方面起着重要作用。覆盖于花药表面的角质层是保证花药和花粉正常发育所必需的屏障,主要成分为蜡质及角质。不过水稻花药角质单体生物合成的分子机制研究还不是十分清楚。在拟南芥中,曾有研究报道HTH基因参与角质单体之一双羧酸的合成,故前人认为拟南芥的HOTHEAD家族参与角质单体合成。本课题主要研究在水稻花药中特异表达的一个HTH同源基因的功能。我们采用RNA干涉与CRISPR技术下调OsHTH1基因的表达,通过细胞学、分子生物学和生物化学手段研究该基因在花药和花粉发育中的功能以及作用机制。主要结果如下:1.构建了 OsHTH1基因的CRISPR及超表达载体,并分别转化得到了T1代CRISPR转基因植株及T0代超表达植株。2.OsHTH1基因的表达模式分析。qRT-PCR的结果显示OsHTH1在营养器官中基本不表达,特异的在小穗发育7期高表达,原位杂交分析该基因在不同发育时期的表达部位。显示OsHTH1在单核靠边期的花药壁表皮细胞中特异表达。3.HTH1-RNAi T3代植株农艺性状观察。HTH1-RNAi T3代植株营养生长阶段与野生型没有差异,而抽穗后干涉植株花药外观短小而发白,花粉碘染结果显示其中可育花粉的数量较野生型显著降低,FDA染色观察发现大量花粉失去活力,最终导致结实率显著下降。表达量检测表明这些表型与基因表达量正相关,表明两者之间共分离。4.CRISPR技术创建突变体hth1 T1代表型分析。单核苷酸缺失突变体hth1花药外观对比野生型明显短小皱缩,花粉碘染及FDA染色结果显示其花粉育性及花粉活力较野生型也显著降低,这些表型与HTH1-RNAi株系一致。5.HTH1-RNAiT3代花药和花粉发育的细胞学观察。石蜡切片结果显示从单核靠边期开始干涉株系花药壁坍塌,花粉败育且最终降解,留下皱缩的花粉囊空腔。扫描电子显微镜分析表明,与野生型相比,OsHTH1-RNAi植株的成熟花粉期花药壁塌陷,花药表皮细胞不规则,花粉皱缩;透射电子显微镜观察到其成熟花粉期花药壁表层角质积累薄而且小孢子空泡化。6.HTH1-RNAi T3代植株花药角质层成分分析。气相色谱质谱法分析表明OsHTH1表达下调后,花药角质成分总量下降,而蜡质无明显变化;花药角质单体成分分析显示其生物合成较野生型有显著缺陷,多类角质单体单位重量显著降低。我们的研究结果表明,OsHTH1对花药表皮角质单体生物合成至关重要,是水稻雄配子的花药角质层发育过程中不可或缺的角色。