铜绿假单胞菌对氨基糖苷类抗生素的耐药性及相关耐药基因研究

作     者：孔伟伟 

作者单位：安徽医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：黄升海

授予年度：2018年

学科分类：1010[医学-医学技术（可授医学、理学学位）] 10[医学] 

主      题：铜绿假单胞菌 耐药机制 氨基糖苷类修饰酶基因 16SrRNA甲基化酶基因 

摘      要：目的通过检测临床分离的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)氨基糖苷类修饰酶基因及16SrRNA甲基化酶基因的表达情况,研究氨基糖苷类修饰酶及16SrRNA甲基化酶与PA耐药的相关性,为指导临床合理化用药及抗菌药物研发提供依据和帮助。方法(1)选择安徽医科大学第一附属医院2013年11月-2015年12月期间的临床标本,经分离纯培养后,采用法国梅里埃公司VETEC 2 COMPACT全自动微生物分析仪鉴定和药敏检测,药敏判断标准按CLSI 2015年版标准规定的临界值判定耐药、中介和敏感,并对9种临床常用代表性抗菌药物的耐药情况进行分析,筛选氨基糖苷类耐药的铜绿假单胞菌菌株。(2)采用聚合酶链式反应对氨基糖苷类修饰酶基因和16SrRNA甲基化酶基因扩增,并进行序列测定及分析。氨基糖苷类修饰酶基型包括aac(3)-I,aac(3)-II,aac(6 )-I,aac(6 )-II,ant(2 )-I和ant(3 )-I共6种,16SrRNA甲基化酶基因型包括armA、rmtA、rmtB、rmtC、rmtD,应用2%琼脂糖凝胶电泳技术分析扩增产物,与阳性对照分子相当的目的条带结果被认为是阳性结果;扩增产物进行纯化和测序,测序结果通过Blast与美国核酸库(GenBank)的rmtB序列比对,比较修饰酶同源性。结果(1)分离鉴定出非同源铜绿假单胞菌60株,药敏结果显示,耐药率最高的是头孢吡肟(60.00%),对阿米卡星、庆大霉素、头孢他啶、亚胺培南、环丙沙星、左氧氟沙星、妥布霉素、哌拉西林-他唑巴坦的耐药率在20%-56.67%之间。筛选出33株对氨基糖苷类抗生素耐药的铜绿假单胞菌,27株对氨基糖苷类抗生素中介及敏感的菌株。(2)33株对氨基糖苷类抗生素耐药的铜绿假单胞菌中,28株检出氨基糖苷类修饰酶基因,检出率84.85%,其中基因aac(3)-II 15株,aac(6 )-I 9株,aac(6 )-II 15株,ant(2 )-I 24株,ant(3 )-I 11株,未检出aac(3)-I基因型,基因检出率依次为ant(2 )-I(32.43%)、aac(3)-II(20.27%)、aac(6 )-II(20.27%)、ant(3 )-I(14.86%)、aac(6 )-I(12.16%),本研究中检出率最高的基因型是ant(2 )-I,同时携带5种、4种、3种、2种和1种氨基糖苷类修饰酶基因的铜绿假单胞菌分别有2株、3株、10株、9株和4株,5株未检出氨基糖苷类修饰酶基因;27株对氨基糖苷类抗生素中介及敏感的菌株均未检出氨基糖苷类修饰酶基因。对氨基糖苷类耐药的铜绿假单胞菌耐药谱显示,15株为多药耐药(三类或三类以上抗生素耐药),有2株同时携带5种耐药基因,同时携带2种或2种以上氨基糖苷类修饰酶基因的菌株为24株,占85.71%。33株氨基糖苷类耐药的铜绿假单胞菌株中有10株检测到一种16SrRNA甲基化酶基因型rmtB,检出率30.3%;27株对氨基糖苷类抗生素中介及敏感的菌株均未检出16SrRNA甲基化酶基因。16SrRNA甲基化酶rmtB基因阳性的菌株显示出对庆大霉素高水平耐药,高值达到MIC512mg/L,未检出armA、rmtA、rmtC、rmtD基因型。(3)经统计学分析,对氨基糖苷类抗生素耐药株氨基糖苷类修饰酶基因携带率显著高于敏感株或中介株(P0.01),对氨基糖苷类抗生素耐药株16SrRNA甲基化酶基因携带率显著高于敏感株或中介株(P0.01)。结论铜绿假单胞菌对氨基糖苷类抗生素耐药率较高,细菌携带氨基糖苷类修饰酶(AMEs)基因是引起本地区铜绿假单胞菌耐药的重要因素之一,而携带16SrRNA甲基化酶rmtB基因与铜绿假单胞菌对氨基糖苷类抗生素高水平耐药密切相关。