酒鬼酒制曲车间空气源可培养细菌多样性研究

作     者：钟小娟 

作者单位：吉首大学 

学位级别：硕士

导师姓名：陈义光

授予年度：2015年

学科分类：0832[工学-食品科学与工程（可授工学、农学学位）] 08[工学] 0836[工学-生物工程] 082203[工学-发酵工程] 0822[工学-轻工技术与工程] 083203[工学-农产品加工及贮藏工程] 

主      题：酒鬼酒制曲车间 空气微生物 生物多样性 胞外水解酶 系统发育分析 多相分类 

摘      要：本研究采用自然沉降法(natural precipitation method)收集酒鬼酒制曲车间空气源微生物,采用传统的纯培养法(culture-dependent method)分离其中的细菌(含放线菌),运用基于16S r RNA基因序列的系统发育分析法(phylogenetic analysis)研究分离菌株的系统发育多样性(类群多样性、物种多样性和遗传多样性),采用水解法对其进行产胞外水解酶特征研究,采用多相分类方法(polyphasic approach)对潜在新分类单位(potential new taxa)的代表性菌株进行系统分类学(taxonomy)研究,以便较系统地了解酒鬼酒制曲车间空气中的可培养细菌的系统发育多样性和产水解酶特征,确立部分潜在新类群代表菌株的分类地位,为进一步研究、保护及利用酒鬼酒酿造微生物资源奠定基础。用添加10%酒鬼酒混合浸汁的营养琼脂、ISP 2和高氏Ⅰ号培养基、采用自然沉降法从酒鬼酒制曲车间空气中分离到83株纯培养物。根据部分形态和生理生化特征,去除部分重复菌株,获得65个菌株用于进一步研究。系统发育多样性分析结果表明,这65个酒鬼酒制曲车间空气源菌株可以分为39个物种,归属于细菌域的4个门(Firmicutes,Actinobacteria,Proteobacteria,Deinococcus-Thermus)的14个科(Deinococcaceae,Bacillaceae,Microbacteriaceae,Brevibacteriaceae,Moraxella,Moraxellaceae,Neisseriaceae,Nocardiopsaceae,Paenibacillaceae,Phyllobacteriaceae,Rhizobium/Agrobacterium group,Rhodobacteraceae,Sphingomonadaceae,Staphylococcaceae)、24个属(Agrococcus,Aliihoeflea,Arthrobacter,Bacillus,Brevibacterium,Closest,Deinococcus,Halobacillus,Kocuria,Paenibacillus,Paracoccus,Prolinoborus,Pseudoclavibacter,Psychrobacter,Rathayibacter,Rhizobium,Staphylococcus,Sphingomonas,Macrococcus,Microbacterium,Micrococcus,Moraxella,Nocardiopsis,Zhihengliuella)。多数菌属于Actinobacteria门(28株,43.1%),其中Micrococcaceae为优势科(12株);其次是Proteobacteria门(19株,29.2%)和Firmicutes门(14株,21.5%);还分离到4株属于分类地位尚未确定、目前根据伯杰氏手册暂称为异常球菌-栖热菌门(Deinococcus-Thermus)的细菌。相似性分析结果显示,大多数菌株与它们的系统发育关系最密切的已知物种之间,存在一定的遗传差异(序列相似性为95.9%9.9%),初步确定其中有6株(JSM 2155001,JSM 2175001,JSM 2175016,JSM 2185017,JSM 2195010,JSM 2195026)可能代表4个已知属(Deinococcus,Sphingomonas,Pseudoclavibacter,Paenibacillus)的6个新的分类单元/物种(potential new taxa/species)。这些结果均表明了酒鬼酒制曲车间空气样品中存在较高的类群多样性和物种多样性。采用水解法对分离自酒鬼酒制曲车间空气样品的细菌(含放线菌)进行产胞外酶(淀粉酶、酯酶、明胶酶和脲酶)的酶学特性研究。结果表明,至少产生一种酶的菌株共54株,占总受试菌株的83.1%。其中有19株对淀粉有水解作用,8株对4种吐温(Tween 20,40,60,80)均有水解作用,17株对明胶有水解作用,26株对尿素有水解作用;有27株产胞外水解酶广谱菌株,能同时至少产生2类水解酶。系统发育分析结果表明这些阳性菌株类群多样性较高。有4株菌株具有较强淀粉水解酶活性(JSM 2145008、JSM 2155001、JSM 2155017、JSM 2175012)属于3个门(Deinococcus-Thermus,Firmicutes,Actinobacteria)的3个科(Deinococcaceae,Bacillaceae,Microbacteriaceae);有8株菌株具有较强酯酶活性(降解