小麦花粉细胞电击法转化体系的优化

作     者：邓艳芳 

作者单位：西北农林科技大学 

学位级别：硕士

导师姓名：张小红

授予年度：2014年

学科分类：09[农学] 0901[农学-作物学] 

主      题：小麦 电击法 花粉 萌发率 结实率 

摘      要：小麦是主要的粮食作物。分子育种可缩短育种年限,弥补常规育种的不足,加快遗传育种的进程。近年来随着转基因技术的不断改进,小麦转基因技术的研究也越来越深入。研究探索更加简单、方便、高效的遗传转化技术对促进小麦基因工程育种具有重要的作用。花粉细胞以其单倍体、单细胞的特点是植物遗传转化的理想受体。而花粉电击转化法是将外源DNA通过电击法导入成熟花粉中,再利用常规杂交授粉的方式实现遗传转化的,是电击法和杂交授粉相结合的一种转化方法。与农杆菌转化法和基因枪转化法等目前主要转基因方法相比,花粉电击转化法具有操作简单、成本较低、省去了组织培养的过程、避免了再生性不强和容易产生嵌合体的问题,而且受体也没有种属限制等优点。目前利用花粉电击法进行遗传转化已成功应用于多种植物。本实验以小麦成熟花粉细胞为转化受体,在前期实验的基础上,通过对电击液、萌发液等电击条件的筛选和优化,以提高小麦成熟花粉细胞的活力和体外萌发率,从而优化其电击转化体系,提高其结实率和小麦花粉细胞电穿孔转化的遗传转化效率,为建立稳定实用的小麦花粉电穿孔转化技术奠定基础;并利用电击转化法对GUS基因及与干旱、低温诱导表达相关的转录因子基因DREB4A、W17进行转化,以获得转基因植株。通过本实验的研究,得到以下结论:(1)通过电击法转化小麦的花粉细胞,然后经过FDA染色和在光学显微镜下直接观察,统计并分析得到小麦花粉细胞电击转化时最适的电击缓冲液为P1,即(20%蔗糖+7%PEG6000)这一组合,此时花粉活力最高,为74.30%,而且显著高于其它处理,比对照高出20.26%。(2)比较了不同成份配比的花粉萌发液对电击后小麦花粉离体萌发的影响,结果表明小麦花粉细胞在进行体外萌发时最适的萌发液为C3,即(475mg/L Ca(NO3)2+10 mg/L VB1)这一组合,此时萌发率最高,为43.22%,而且也是显著高于其它处理,比对照高出27.33%。(3)利用经过优化后的电击缓冲液P1组合和优化后的体外萌发液C3组合进行电击操作和电击之后的授粉操作,以济麦22为受体分别转化了报告基因GUS和两个转录因子基因DREB4A和W17,平均结实率为3.37%,比对照的结实率0.88%高出2.49%;对获得的种子经萌发后取叶片进行PCR检测,结果显示得到了 2株转DREB4A基因的转基因植株,转化率为0.59%。