PTEN与RACK1相互作用参与鼻咽癌发病的机制研究

作     者：龚平桂 

作者单位：南方医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：彭宏

授予年度：2016年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：PTEN RACK1 蛋白相互作用鼻咽癌 

摘      要：目的和意义鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)是发生于鼻咽顶部及双侧咽隐窝的恶性肿瘤。在全球绝大多数国家是一种罕见疾病,发病率不到10万分之一,而在中国南部、非洲北部和阿拉斯,其加发病率明显增高。在我国尤其好发于广东省,又被称为“广东癌。由于鼻咽癌发生部位隐蔽,早起症状不典型,难以被早期诊断。另一方面,绝大多数鼻咽癌属于未分化鳞状细胞癌,容易发生早期转移。因此,大部分病人明确诊断时已属于临床中晚期。虽然,同步放疗化疗提高五年生存率(72.3%)、放疗技术的改善、早期发现肿瘤复发以及运用适当的外科手术在一定程度上提高了鼻咽癌的治疗效果。但是复发和远处转移仍是鼻咽癌治疗失败的主要原因。这意味着全面深入了解鼻咽癌的发病机制,发现鼻咽癌的早期诊断标记和治疗靶点具有重要的临床意义。PTEN是参与人类多种恶性肿瘤发病的重要抑癌基因,具有脂质磷酸酶活性和蛋白磷酸酶活性的双重特异性磷酸酶活性,其缺失或功能异常与鼻咽癌的发生发展密切相关。以往研究已经证明PTEN的抑癌功能主要是依赖于PTEN的脂质磷酸酶活性。PTEN能够使PIP3的D3位磷酸基团发生去磷酸化而转化成PIP2,进而抑制PI3K/Akt信号通路活化。PTEN不仅能够通过负性调控PI3K/Akt信号通路抑制细胞生存、诱导细胞程序性凋亡和细胞周期阻滞,也能够调节细胞粘附运动和分化;此外,PTEN缺失活化PI3K/Akt信号通路增强肿瘤细胞的干性如胶质瘤和前列腺癌,也降低了前列腺癌和乳腺癌对化疗药物的敏感性。近年来随着研究的深入,人们发现除了 PTEN脂质磷酸酶活性发挥重要的抑癌功能,蛋白间相互作用也是调节PTEN功能和活性的重要方式。比如,PTEN蛋白磷酸酶活性、不依赖PTEN磷酸酶活性的抑癌作用以及翻译后修饰调控PTEN磷酸酶活性和功能均涉及到PTEN与多种蛋白间的相互作用机制。因此,对PTEN功能及其调控机制的深入研究将有利于揭示鼻咽癌发病的分子机制,为鼻咽癌的分子诊断和治疗寻找新的分子标记物及新靶点。PTEN的结构决定PTEN能够与多种蛋白发生相互作用。PD区是PTEN磷酸酶活性的功能区,是发挥抑癌功能的重要部位。C2区介导PTEN与质膜的结合。C端尾调节PTEN与蛋白的结合。另外,PTEN的晶体结构PD区和C2区是有序结构区域,而C端尾部在本质上是无序区域,C端尾部的无序性增强了PTEN的蛋白蛋白相互作用。总之,PTEN结构的灵活性和可塑性使PTEN具有丰富的功能。靶向PTEN的内在无序区域或相互作用蛋白已成为治疗PTEN相关疾病的新策略。通过生物信息学预测,能与PTEN相互结合的蛋白有几百种,大部分相互作用的蛋白与肿瘤发生发展密切相关。也有实验研究筛选出野生型PTEN与突变体PTENG20E(失去蛋白磷酸酶活性,保留脂质磷酸酶活性)相结合的差异蛋白。通过同位素标记培养基中氨基酸为基础,进行亲和纯化质谱分析(SILAC)的方法发现 PTEN 能与活性蛋白激酶 C 受体(Receptor for activated protein kinase C)结合,但是没有进一步深入研究证明两者是否存在相互作用及其作用机制。活性蛋白激酶C受体(RACK1)是一个桥梁蛋白,具有7个WD40结构域,蛋白分子量为36kDa,主要表达于胞质。RACK1在蛋白间相互作用中发挥桥接作用,参与不同的信号通路。RACK1通过将结合蛋白运输到特定的发挥功能的部位,调节结合蛋白的活性,调节结合蛋白的稳定性,促进或抑制结合蛋白与其他蛋白的结合等方式发挥重要作用。另一方面,磷酸化修饰是目前唯一明确的调节RACK1功能活性的重要翻译后修饰,可调节RACK1的蛋白结合及细胞定位。RACK1能够调节细胞生长、粘附运动、分化、免疫反应等多种细胞活动。最近,研究发现RACK1在多种肿瘤中高表达,如黑色素瘤、乳腺癌、结肠癌、肺腺癌、肝癌、食管鳞状细胞癌和口腔鳞状细胞癌。RACK1能够促进肿瘤的生长、侵袭和转移。然而,另有研究报道:RACK1可以抑制Src活性,进而抑制Ki-Ras介导的NIH3T3细胞生长和形态转化。RACK1在胃癌组织中表达下调,通过负性调节Wnt信号通路而发挥抑癌功能。有趣的是,越来越多的研究表明,RACK1能够与EBV编码的相关蛋白相互结合,如ZEBRA、LMP1和A73。这些异常分子在鼻咽癌发病中发挥重要作用。这意味着RACK1可能在鼻咽癌发生发展过程中发挥着重要作用。至今为止,RACK1在鼻咽癌中的表达和功能及分子机制未见报道。大量研究证明PTEN通过脂质磷酸酶活性在鼻咽癌中发挥重要抑癌功能,但是PTEN的蛋白磷酸酶活性以及蛋白间相互作用在鼻咽癌发病中的分子机制研究未见报道,因此,本课题拟探索鼻咽癌中PTEN能否与RACK1相互结合以及其相互作用的分子机制和细胞功能改变,为研究与鼻咽癌发病相关的PTEN蛋白相互作用奠定基础,也有助于寻找新的鼻咽癌诊断标志或发现新的治疗靶点。方法1.RACK1在鼻咽癌中的表达1)通过免疫组织化学、RT-PCR和Western Blot检测RACK1在鼻咽癌组织与鼻咽癌细胞中的表达。2)通过激光共聚焦和免疫荧光实验,检测RACK1在鼻咽癌细胞中的表达定位。3)结合临床病历资料分析,预测RACK1在鼻咽癌中的作用。2.RACK1在鼻咽癌中的功能1)构建RACK1过表达质粒和siRNA干扰片段。2)检测细胞株中过表达或干扰RACK1的效率。3)应用MTT实验、平板克隆实验和EdU实验,检测RACK1对鼻咽癌细胞生长和增值的影响。4)应用transwell实验和boyden实验,检测RACK1对鼻咽癌细胞迁移和侵袭能力的影响。3.PTEN和RACK1的结合及其结合区域1)应用免疫共沉淀实验,证明PTEN与RACK1的相互结合。2)应用邻位连接技术(PLA实验),从细胞生理水平验证PTEN和RACK1的结合。3)应用免疫共沉淀实验,证明PTEN与RACK1相互作用的结合区域。4.RACK1和PTEN相互作用的分子机制1)过表达RACK1和干扰RACK1表达后,通过westrn blot检测PI3K/Akt/FAK信号通路中多种蛋白表达的变化。2)过表达PTEN,通过westrn blot检测PI3K/Akt/FAK信号通路中多种蛋白表达的变化;过表达PTEN的细胞株,给予PMA刺激活化PKC/RACK1后,westm blot检测PI3K/Akt/FAK信号通路中多种蛋白表达的变化。3)Western Blot检测PTEN和RACK1相互作用对彼此总蛋白表达水平的影响。结果1.RACK1在鼻咽癌中的表达1)通过生物信息学预测并结合文献报道,筛选RACK1作为研究鼻咽癌中PTEN蛋白相互作用机制的靶蛋白。2)免疫组织化学实验检测RACK1在鼻咽癌组织和非癌鼻咽部上皮组织中的表达。通过免疫组化实验,检测58例鼻咽癌组织和37例非癌鼻咽部组织中RACK1蛋白表达水平。结果:98%(57/58)的鼻咽癌组织中检测到了 RACK1,而非癌组织标本中只有86%(32/37)的标本检测到RACK1;以大于4分作为高表达进行评分统计,76%(44/45)的鼻咽癌组织RACK1高表达,而非癌鼻咽部组织中只有30%(11/37)相对高表达;以上数据证明,在鼻咽癌组织标本中,RACK1蛋白表达显著高于非癌鼻咽部组织,经统计学分析P0.001。3)RACK1在鼻咽癌细胞株中的表达运用qRT-PCR和Western Blot实验检测RACK1在鼻咽癌细胞株和永生化鼻咽部上皮细胞NP69中的表达水平。结果显示:与NP69相比,RACK1mRNA在鼻咽癌细胞中无明显升高,甚至一些细胞中有下降的趋势;在高度恶性的鼻咽癌细胞株(5-8F、CNE1和CNE2)中,RACK1蛋白的表达水平明显高于相对低度恶性的鼻咽癌细胞株(HONE1、6-10B),以及永生化鼻咽部上皮细胞NP69。4)共聚焦实验和免疫荧光实验证实RACK1在鼻咽癌中的表达定位共聚焦实验观察鼻咽癌组织中RACK1的亚细胞定位,以claudin-1作为细胞膜标记物,DAPI染核,发现RACK1主要在细胞质表达。细胞免疫荧光实验也显示RACK1主要位于细胞质。5)RACK1表达与临床病理资料的关系为了明确RACK1在鼻咽癌中是否具有重要作用,首先分析RACK1蛋白表达水平与鼻咽癌临床病理特征之间是否具有相关性。经统计分析发现:RACK1表达与鼻咽癌患者的性别、年龄及肿瘤大小无明显相关性,但是与肿瘤患者的淋巴结转移及临床分期具有明显相关性。2.细胞功能实验研究RACK1对鼻咽癌细胞生长、迁移、侵袭的影响1)鼻咽癌细胞中有效过表达RACK或干扰RACK1进行酶切和测序鉴定质粒pEGFP-N1-RACK1的准确性;Western Blot实验证实鼻咽癌细胞转染质粒后成功过表达RACK1,且融合蛋白GFP-RACK1的分子量大小约为60-70kDa;合成的3个RACK1 siRNA干扰片段能够有效降低RACK1在鼻咽癌细胞中的表达,并选择两个干扰片段进行后续实验。2)RACK1促进鼻咽癌细胞生长增殖在鼻咽癌细胞5-8F与CNE1中过表达RACK1或者干扰RACK1,进行MTT,EdU和平板克隆实验研究,评估RACK1对鼻咽癌细胞生长活性的影响。实验结果表明:过表达RACK1促进鼻咽癌细胞生长增殖,干扰RACK1后抑制鼻咽癌细胞的生长增殖。3)RACK1促进鼻咽癌细胞迁移和侵袭鼻咽癌细胞过表达RACK1或干扰RACK1后进行Transwell和Boyden实验,探讨RACK1对鼻咽癌细胞运动侵袭能力的影响。结果表明:过表达RACK1能促进鼻咽癌细胞的运动和侵袭;干扰RACK1能抑制细胞的运动和侵袭。3.验证PTEN和RACK1在鼻咽癌细胞中存在相互作用1)PTEN和RACK1相互结合免疫共沉淀实验检测PTEN和RACK1的结合。PTEN的标签抗体anti-HA和特异性anti-RACK1抗体分别进行免疫沉淀实验,IgG作为免疫沉淀实验抗体的阴性对照,正反向免疫共沉淀产物中均检测到PTEN与RACK1条带,免疫共沉淀实验结果说明:PTEN与RACK1蛋白可以相互结合。PLA实验结果显示:鼻咽癌细胞CNE1过表达HA-PTEN后,anti-HA(抗鼠)与anti-RACK1(抗兔)共同孵育进行PLA实验,产生点状红色荧光,而单一抗体的对照组没有荧光,进一步证实在细胞内PTEN能与RACK1结合。2)PTEN和RACK1相互结合区域我们构建野生型RACK1及RACK1的各截短突变体Myc-RACK1,Myc-WD3-4及Myc-WD5-7质粒,免疫共沉淀实验研究PTEN与RACK1的结合区域。结果表明野生型RACK1以及RACK1的WD5-7结构域均能与PTEN结合,然而RACK1的WD3-4结构域不能与PTEN结合。4.鼻咽癌中PTEN和RACK1相互作用的可能机制1)PTEN直接结合RACK1调节PI3K/Akt、FAK信号通路影响鼻咽癌的进展在鼻咽癌中,PTEN能够抑制Akt和FAK活化;过表达及活化RACK1能够促进Akt和FAK的活化;干扰RACK1抑制Akt和FAK的活化。2)PTEN与RACK1相互作用不影响彼此的蛋白表达水平在鼻咽癌细胞株中,PTEN与RACK1的表达未见明显相关性,过表达PTEN后RACK1的表达水平无明显变化,干扰RACK1后PTEN的表达水平也无明显改变。故PTEN与RACK1相互作用不影响彼此的蛋白表达水平,PTEN结合RACK1可能通过影响蛋白修饰或蛋白定位或蛋白竞争性结合的调节机制而发挥作用。结论1.RACK1在鼻咽癌组织中表达上调,且与鼻咽癌患者临床进展密切相关。2.RACK1促进鼻咽癌的增殖、迁移和侵袭。3.RACK1可以和PTEN相互结合,结合区域为RACK1WD5-7。4.PTEN结合RACK1调节PI3K/Akt/FAK信号通路影响鼻咽癌的进程。