MDA-7基因的腺病毒载体构建及其肿瘤靶向治疗的实验研究

作     者：王艳 

作者单位：江苏大学 

学位级别：硕士

导师姓名：江淑芳

授予年度：2008年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：复制缺陷性腺病毒 端粒酶逆转录酶启动子 肿瘤基因治疗 

摘      要：目的构建端粒酶逆转录酶启动子调控目的基因MDA-7表达的复制缺陷型腺病毒,初探MDA-7蛋白对肿瘤细胞的杀伤效应。 方法通过基因操作技术将启动子(hTERTp)+目的基因(MDA-7)插入到腺病毒穿梭载体中,构建复制缺陷型腺病毒AdTP-mda7;同时构建对照病毒AdTP-EGFP。在HEK293细胞中扩增,氯化铯密度梯度离心纯化病毒,TCID法测定病毒滴度,应用Western blot检测经腺病毒传递的MDA-7在肿瘤细胞株中表达;通过结晶紫染色实验检测两种病毒对肿瘤细胞的杀伤效应差异,拍照。 结果成功构建携带目的基因的腺病毒穿梭质粒pSuTP-mda7,PCR鉴定正确;成功制备腺病毒颗粒AdTP-mda7和Ad-EGFP并测得AdTP-mda7滴度为2.69×10pfu/ml、AdTP-EGFP滴度为1.8×10pfu/ml。Western blot分析,MDA-7选择性在多种肿瘤细胞株中表达,诱导肿瘤细胞死亡,如肺腺癌细胞株A549、胃癌细胞株SGC7901等,在相同条件处理的原代成纤维细胞中MDA-7表达低于可检测下限水平。Violet staining test结果证明,肿瘤细胞感染AdTP-mda7后细胞大量死亡的MOI值为10,感染对照病毒的肿瘤细胞在MOI为10 000时才出现明显的死亡。 结论成功构建复制缺陷型腺病毒AdTP-mda7,并证实MDA-7蛋白在肿瘤细胞中过表达导致多种肿瘤细胞株死亡,对肿瘤靶向性基因治疗具有重大研究意义。