胚胎干细胞与聚3-羟基丁酸酯-co-4-羟基丁酸酯共培养心肌补片的研究

作     者：马义祥 

作者单位：首都医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：穆军升

授予年度：2017年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100201[医学-内科学(含：心血管病、血液病、呼吸系病、消化系病、内分泌与代谢病、肾病、风湿病、传染病)] 10[医学] 

主      题：胚胎干细胞 心肌补片 维生素C 聚3-羟基丁酸酯-co-4-羟基丁酸酯 三维培养 

摘      要：目的:对比研究添加和不添加维生素C促进小鼠胚胎干细胞(ES细胞)与聚3-羟基丁酸酯-co-4-羟基丁酸酯[P(3HB-co-4HB)]共培养分化成心肌补片,观察心肌细胞在生物膜上的生长,增殖及诱导分化,分析并计算两组的诱导分化效率曲线,得到维生素C是否在胚胎干细胞与P(3HB-co-4HB)共培养时促进分化为心肌补片;从而为干细胞治疗心肌梗死提供心肌补片支架材料。方法:获取小鼠胚胎纤维状细胞(MEF)原代培养,传代和处理;复苏小鼠胚胎干细胞,传代培养,消化离心后重悬细胞,用悬滴法形成拟胚体,拟胚体与细胞补片共培养,72小时共培养后固定并进行共聚焦显微镜观察细胞粘附情况,DAPI荧光染色观察细胞在P(3HB-co-4HB)膜上形态。分为两组,实验组用含维生素C(浓度1×10-4mol/L)的培养基培养,对照组用不含维生素C的培养基培养;免疫荧光染色检测心肌细胞特异标志物肌钙蛋白(cTnT),肌动蛋白(α-actin);扫描电镜下观察心肌补片;从EB与补片共培养第7天开始,隔天观察并统计两组各15个心肌补片上的心肌细胞,计算诱导分化效率,绘制分化效率随诱导时间的分布图。结果:MEF细胞和ES细胞在培养皿中贴壁生长良好,形态正常;EB与细胞补片共培养后,cTnT,α-actin染色阳性;荧光显微镜下,所有拟胚体都在三维材料表面良好生长,爬膜率为100%;Confocal共聚焦显微镜下观察到在2mm的厚度上,每个层次都有心肌细胞与三维生物膜的存在;心肌细胞cTnT,α-actin染色阳性;扫描电镜下,P(3HB-co-4HB)材料与心肌细胞共培养形成的心肌补片,其表面细胞数量多,细胞形态正常,与三维膜结合紧密。绘制分化效率随诱导时间的分布图,显示分化效率随时间逐渐增高,添加维生素组分化效率明显高于不添加维生素C组,不加维生素C组最高诱导率为17.8%,加维生素C组最高诱导率为71.1%。结论:ES细胞可在P(3HB-co-4HB)生物补片上生长,增殖,分化为心肌细胞,且添加维生素C能显著增加诱导成心肌细胞的概率。P(3HB-co-4HB)这种新型高分子三维材料可以作为干细胞移植治疗心肌梗死的补片材料。