低值鱼低聚肽的酶法制备及抗氧化、抗疲劳活性研究

作     者：丁树慧 

作者单位：吉林农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：张晶

授予年度：2018年

学科分类：1008[医学-中药学(可授医学、理学学位)] 1006[医学-中西医结合] 100602[医学-中西医结合临床] 10[医学] 

主      题：低值鱼蛋白 酶解技术 分离纯化 抗氧化 抗疲劳 

摘      要：本文以蛋白含量丰富的低值海洋鱼粉为原料,研究双酶分步酶解法水解低值鱼粉蛋白的工艺条件,制备出低值海洋鱼低聚肽,并采用高效凝胶过滤色谱法对其分子量进行了测定。借助体外化学模型评价了低值海洋鱼低聚肽的抗氧化活性,并集超滤、凝胶过滤色谱及RP-HPLC等多种分离技术对其进行逐级提纯,最后以飞行时间质谱技术分析鉴定出最高抗氧化肽的一级序列结构,并采用体内动物模型研究了其抗疲劳功效。旨在开发利用海洋可再生资源,寻找具有生理活性的小分子肽物质,开发海洋药物和功能性海洋保健品,变废为宝。主要研究结果如下:以水解度为考察指标,选用6种蛋白酶(碱性及中性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、复合及风味蛋白酶)进行单一酶解筛选试验,然后进行复合酶解实验,制备分子量低、肽含量高的低值海洋鱼功能性低聚肽。通过单因素和响应曲面优化法研究酶解温度、加酶方式、总加酶量、pH值、酶解时间对低值鱼粉蛋白水解工艺的影响。研究表明,碱性蛋白酶和中性蛋白酶先后加入的方式水解效果较高,酶活力配比为6:4,E/S为2500 U/g,最佳酶解温度为50°C,pH为8时碱性蛋白酶酶解5 h,pH为7时中性蛋白酶酶解6 h,水解度高达41.84%。酶解后的低值海洋鱼低聚肽的相对分子质量分布集中在180000 Da之间,说明双酶酶解虽提高了低值鱼粉蛋白的水解度,但主要酶解产物仍是低分子寡肽,没有水解过度生成大量游离氨基酸。用4种体外化学模型和DNA氧化损伤模型综合评价低值海洋鱼低聚肽的抗氧化活性,结果表明其还原力与GSH相当,其清除DPPH自由基及超氧阴离子自由基能力比GSH稍弱,但其对羟自由基清除能力远高于GSH,同时还表现出对DNA氧化损伤的保护能力。利用超滤、凝胶过滤色谱和RP-HPLC等多步分离技术对低值海洋鱼低聚肽进行分离纯化,最后得出目标肽段清除羟自由基能力IC为2.47±0.09 mg/mL,比分离前提高了2.06倍,说明分离纯化过程能显著地富集抗氧化肽。最后通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术鉴定出功能肽段的氨基酸序列为Thr-Pro-Ser-Ala-Gly-Lys,分子量559.3 Da。经美国化学文摘及肽图谱库检索得出,该肽段为初次发现的具有显著抗氧化活性的六肽。对分级得到的低值鱼低聚肽组分IV-4-1进行了体内抗疲劳功效评价,结果表明:低值鱼低聚肽IV-4-1对小鼠的体重和生长无影响;能显著延长小鼠力竭游泳时间,低、中、高剂量组分别是空白对照组的1.53、1.69和2.13倍,其浓度与小鼠游泳时间呈正相关性;与空白对照组相比,低值鱼低聚肽IV-4-1组分的各剂量组提高了肝糖原含量,有效降低了小鼠体内LA和BUN的含量;低值鱼低聚肽IV-4-1各剂量组分别提高小鼠体内抗氧化酶系CAT、SOD和GSH-Px的活力达24.47%-55.36%、10.89%-30.70%和20.74%-41.12%,加快小鼠体内过量自由基的清除,从而达到抗疲劳功效。通过分析低值鱼低聚肽IV-4-1体内抗氧化活性和其抗疲劳功效之间的相关性,发现两者之间显著相关。