灵芝细胞中参与灵芝酸生物合成细胞色素P450基因的筛选与分析

作     者：姜露熙 

作者单位：昆明理工大学 

学位级别：硕士

导师姓名：徐军伟

授予年度：2018年

学科分类：1008[医学-中药学(可授医学、理学学位)] 081703[工学-生物化工] 08[工学] 0817[工学-化学工程与技术] 0836[工学-生物工程] 082203[工学-发酵工程] 0822[工学-轻工技术与工程] 10[医学] 

主      题：灵芝 灵芝酸T 甲羟戊酸途径 细胞色素P450 转录组分析 

摘      要：灵芝酸是一种灵芝生产的高度氧化的羊毛甾醇类衍生物,它具有抗癌、抗HIV等重要的药理学活性。目前灵芝酸生物合成途径仍未完全清楚,尤其是从中间代谢产物羊毛甾醇骨架修饰到形成灵芝酸的过程。研究表明,细胞色素P450可能参与了羊毛甾醇的修饰过程。目前仅发现cyp5150l8参与羊毛甾醇骨架C-26位羧基的形成,而其它相关的P450基因仍未清楚。本文首先研究了灵芝在灵芝酸高产/低产(液体静置/振荡)培养条件下的差异表达基因,发现共有3321个基因表达上调。对上调基因进行分析发现含有可能与类固醇结合的CYP512和CYP5144家族P450基因,结合文献分析,我们从中筛选出了10个与羊毛甾醇合酶基因lss表达正相关的CYP512和CYP5144家族P450基因。通过荧光定量PCR分析了所获得的10个P450基因在灵芝液体静置/振荡培养方式下的表达量,结果表明5个P450基因cyp512a3,cyp512a11,cyp5144n1,cyp512u4和cyp512v2在液体静置培养条件下的表达量分别是振荡培养条件下表达量的7.2,3.7,3.4,89.8和63.4倍。我们分析了这5个P450基因在液体静置/振荡动态培养条件下的表达量与灵芝酸T积累的相关性,发现cyp512v2和cyp512a3的表达量与灵芝酸T的含量正相关,相关系数分别为0.954和0.992,p值分别为0.046和0.008;进一步研究了这5个P450基因在不同培养(液体振荡、液体静置、静置钙离子添加、静置氮缺陷)方式下的表达量与灵芝酸T含量的相关性,结果显示cyp512v2的表达量与灵芝酸T的含量正相关,相关系数为0.992,p值为0.008。在灵芝细胞内对cyp512v2基因进行了基因沉默,获得了9株沉默菌株,基因组PCR验证结果表明沉默载体成功整合入沉默菌株中,荧光定量测定9株沉默菌株中cyp512v2基因的表达量分别被抑制了52%,75%,76%,27%,3%,36%,23%和49%。挑选了沉默效率较高的3株基因沉默菌株进行培养发酵,结果显示3株沉默菌株内灵芝酸T的含量分别比野生型菌株的含量降低了13%,69%和66%,结果暗示cyp512v2可能参与了灵芝酸T的生物合成。本研究获得了可能参与灵芝酸生物合成的候选P450基因cyp512v2,进一步通过酵母异源表达及在灵芝细胞内对cyp512v2基因进行缺失、回补等方法将明确其在灵芝酸生物合成途径中的作用。本研究对深入了解灵芝酸的生物合成和代谢调控具有重要的意义。