EPAC对乙醛诱导的大鼠肝星状细胞增殖和激活的作用

作     者：杨岩 

作者单位：安徽医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：吕雄文

授予年度：2016年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100201[医学-内科学(含：心血管病、血液病、呼吸系病、消化系病、内分泌与代谢病、肾病、风湿病、传染病)] 10[医学] 

主      题：乙醛 大鼠肝星状细胞 EPAC1 EPAC2 Rap1 

摘      要：酒精性肝病(alcoholic liver disease, ALD)是由于长期大量饮酒而导致的肝脏损害性病变。酒精性肝纤维化(alcoholic liver fibrosis, ALF)是ALD进展为酒精性肝硬化或肝癌的中间阶段和必经病理过程。在ALF的发生过程中,乙醇可通过其直接代谢产物乙醛激活肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC),活化的HSC是肝纤维化过程中细胞外基质(Extra cellular matrix,ECM)的主要来源,也是各种因素所致肝纤维化发生的核心和关键环节。cAMP信号通路是细胞内非常重要的信号传递途径之一,最初认为蛋白激酶A(PKA)是其唯一的下游效应因子。cAMP/PKA通过磷酸化cAMP反应序列结合蛋白(CREB)的Ser-133位点使之活化,然后作用于cAMP反应序列影响基因表达,进而调控细胞的生长、分化。课题组前期研究已经探讨了cAMP/PKA/CREB信号通路在大鼠酒精性肝纤维化模型和乙醛刺激的大鼠肝星状细胞中的作用。EPAC(exchange protein directly activated by cAMP)是一种由cAMP激活的鸟嘌呤核苷酸交换因子(guanine nucleotide exchange factors,GEFs),又称为cAMP-GEF,是1998年de Rooij等新发现的独立于PKA的cAMP下游效应因子,在许多重要的细胞生理病理进程中都发挥重要的调控作用。这提示了cAMP细胞中的效应可能不只是由以前鉴定的靶蛋白所介导。cAMP通过EPAC活化Rapl, Rapl是Ras样的小分子G蛋白,通过与EPAC结合而被活化,EPAC能增加这类小分子G蛋白对GTP的摄取并使之形成有活性的GTP结合构象。目前为止已发现了两种EPAC亚型：EPAC1 (RapGEF3)和EPAC2 (RapGEF4),由不同的基因编码。那么,EPAC基因是否在大鼠肝星状细胞中表达呢?如果表达又起到什么样的作用呢?是否和PKA作用相同?因此,本课题的研究内容是在采用乙醛诱导HSC-T6细胞建立离体大鼠酒精性肝纤维化HSC模型的基础上,运用RNA干扰技术和EPAC激动剂,观察EPAC1和EPAC2的表达对α-SMA、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ表达的影响,为酒精性肝纤维化的防治提供新的靶点。主要内容概括如下：***在大鼠肝星状细胞中的表达情况实验采用大鼠HSC-T6细胞系为研究对象,用浓度为200μM乙醛处理细胞48 h,实时荧光定量PCR (qRT-PCR)、Western blot分别检测EPAC1和EPAC2的mRNA与蛋白的表达水平。结果显示,EPAC1和EPAC2在正常HSC均有表达,与正常组比较,经200μM乙醛作用48 h后,HSC模型组EPAC2表达水平明显增高,而EPAC1表达水平显著下降。提示EPAC1和EPAC2在乙醛诱导的HSC中可能起到不同的作用。2. EPAC对乙醛刺激的HSC—T6增殖和激活的作用实验设正常对照组(常规培养), 模型组,EPAC激动剂(8-(4-Chlorophenylthio)-2’-O-methyladenosine 3’,5’-cyclic monophosphate monosodium hydrate, Me-cAMP)组。除正常对照组外其余各组均以200μM乙醛作用48 h,制备大鼠酒精性肝纤维化HSC模型。Me-cAMP组在乙醛作用24 h后再加入Me-cAMP继续共同作用24 h。利用MTT法检测Me-cAMP对细胞增殖的影响;流式细胞仪检测Me-cAMP对细胞周期的影响。qRT-PCR及Westernblot法分别检测HSC-T6的α-SMA、Ⅰ型和III胶原mRNA和蛋白表达以及Rapl的蛋白表达。与模型组比较,Me-cAMP明显增加了EPAC1和2的表达,使EPAC1的表达升高了约三倍,并且使细胞增殖活力明显下降。流式细胞分析表明Me-cAMP使S期和G2/M期细胞数目比例显著下降。qRT-PCR及Western blot实验表明α-SMA、Ⅰ型和Ⅲ胶原的表达与模型组比较,均呈现出显著下降。当EPAC被激活之后,EPAC的下游分子Rap1活性形式Rap1-GTP的蛋白表达也同样上升。以上结果提示,在HSC存在EPAC/Rap1信号通路,并且EPAC激活后,乙醛诱导的的HSC-T6的激活和增殖均受到抑制。3、EPAC siRNA在乙醛刺激的HSC—T6中的作用建立上述HSC模型,设计并合成EPAC1和EPAC2小干扰RNA (small interfering RNA,siRNA),通过脂质体Lipofectamine TM 2000瞬时转染至HSC-T6细胞内,荧光倒置显微镜观察