重组耶氏解脂酵母合成反-10，顺-12-共轭亚油酸影响因素的研究

作     者：李敏 

作者单位：江南大学 

学位级别：硕士

导师姓名：宋元达

授予年度：2014年

学科分类：081702[工学-化学工艺] 081703[工学-生物化工] 08[工学] 0817[工学-化学工程与技术] 0836[工学-生物工程] 082203[工学-发酵工程] 0822[工学-轻工技术与工程] 

主      题：重组耶氏解脂酵母 共轭亚油酸 影响因素 摇瓶发酵 补料发酵 

摘      要：共轭亚油酸（Conjugated linoleic acid，CLA）是一系列具有共轭双键的十八碳二烯酸的统称，是亚油酸（Linoleic acid，LA）的立体几何异构体。由于其重要的生理活性功能而受到广泛关注。通过化学方法得到的CLA是多种异构体的混合物，分离成本昂贵。生物法合成的CLA，具有活性结构较单一、安全性较高的优点，成为CLA合成技术的发展趋势。本文以所在实验室构建的高产t10，c12-CLA的重组耶氏解脂酵母为出发菌株，以菌体生物量、胞外Lip2比酶活、t10，c12-CLA产量为指标，在摇瓶水平上研究底物、培养基中营养物质、培养条件和补料发酵对重组耶氏解脂酵母t10，c12-CLA合成的影响。论文的主要研究内容如下： （1）研究了菌体处于不同生长状态时，添加底物及添加量对t10，c12-CLA合成的影响。确定菌体的稳定期前期为红花籽油最适添加时间，此时PAI积累量最高，底物添加后能够诱导重组菌株快速合成并分泌大量脂肪酶Lip2，得到的t10，c12-CLA总产量达到4.2g/L;综合考虑衡量产物总产量及转化率两项指标，红花籽油最适添加浓度为30g/L，产物总产量及转化率分别为9.1g/L和30.3%。 （2）研究了培养基中营养物质对重组菌株t10，c12-CLA合成的影响。确定葡萄糖和有机氮是重组菌株合成产物的最佳碳、氮源;不同乳化剂的乳化效果非离子型阴离子型阳离子型，非离子型中吐温-80为最佳乳化剂，产物总产量是对照组的2.6倍;Zn2+和Fe2+抑制重组酵母菌株中PAI的表达，Cu2+抑制菌体生长及脂肪酶Lip2酶活，发酵初期添加Ca2+生物量和Lip2酶活与对照组相比提高了18.7%和101.5%，产物的总产量高达13.4g/L，是对照组结果的1.4倍。 （3）研究了发酵条件对重组菌株t10，c12-CLA合成的影响。结合发酵过程中培养基pH的变化，考察培养基初始pH的变化对产物合成的影响，发现诱导重组菌株合成脂肪酶Lip2的最适pH在6.0-6.5范围内;恒温培养时，低温有利于菌体生长，但会抑制脂肪酶Lip2的合成以及Lip2的酶活。因此采用变温培养策略，即28℃作为菌体培养温度，在胞外Lip2酶量最高时（发酵70h左右）升温至36℃，可有效地提高产物的总产量（16.2g/L），是28℃恒温培养时产量的1.7倍。 （4）研究补料发酵对重组菌株t10，c12-CLA合成的影响，在重组菌株处于对数期末期补加10g/L葡萄糖，菌体生物量是对照组结果的1.2倍，同时增加了单位细胞PAI的表达量，产物的总产量提高至12.3g/L，是对照组结果的1.4倍;红花籽油添加终浓度为50g/L时，产物总产量提高到18.9g/L，单位细胞产物合成量是添加30g/L红花籽油结果的1.5倍;二次补加葡萄糖，添加50g/L红花籽油，菌体生物量及CLA总产量进一步提高到19.6g/L和22.3g/L。综合最优发酵条件，产物产量最终为31.9g/L，是已报道最高产量的8.0倍之多。 本文通过摇瓶发酵模式，找到影响重组耶氏解脂酵母合成t10，c12-CLA的因素，显著提高了CLA的产量，证明了重组酵母菌株具有高效合成CLA的巨大潜力，为实现生物转化法生产t10，c12-CLA单体提供理论依据和实验基础。