抗多重耐药性金黄色葡萄球菌（MRSA）菌株SC-2的物质基础研究

作     者：邹远军 

作者单位：重庆理工大学 

学位级别：硕士

导师姓名：郑一敏

授予年度：2017年

学科分类：1007[医学-药学(可授医学、理学学位)] 10[医学] 

主      题：多重耐药性金黄色葡萄球菌 枯草芽孢杆菌 分离纯化 结构鉴定 活性评价 含量测定 

摘      要：多重耐药性金黄色葡萄球菌（Methicillin—resistant Staphylococcus aureus,MRSA）是一种遍布全球的高致死病原菌,被称为“超级细菌,目前MRSA感染已经超过艾滋病（HIV）、结核病和病毒性肝炎成为患者首位致死原因,严重威胁公共卫生安全。MRSA对常见抗菌药物耐药现象严重,临床使用的首选药物万古霉素也已分离出耐药菌株,给临床用药带来了巨大的困难。寻求能够有效替代万古霉素的抗MRSA先导化合物,开发治疗MRSA感染的新型抗菌药物具有重大意义。本课题以MRSA为指示菌筛选出一株高产生物活性物质的芽孢杆菌,在对其发酵工艺进行优化化后,系统研究了发酵液中抗MRSA有效成分的分离方法、结构鉴定、体外活性评价及其含量测定。获得如下成果:1.从45株芽孢杆菌中筛选出一株对MRSA具有较强抑制作用且稳定性好的菌株SC-2,通过对其形态观察、生理生化特征及16S rDNA序列的测定,鉴定该菌株为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。2.优化出菌株SC-2的发酵培养基:C6H12O6 2.0%、黄豆粉0.5%、CaCO3 0.05%,pH7.0;菌株SC-2产抗MRSA活性物质的种子液培养条件:温度36℃、接种量5%（V/V）、装液量1000mL/2000m L瓶、时间16h;50L发酵罐参数:温度36℃、接种量5%（V/V）、转数150 r/min,通气量1.5 m3/h,罐压0.05MPa,装液量25L;700L发酵工艺:温度36℃、接种量7%（V/V）、转数150 r/min,通气量21 m3/h,罐压0.05MPa,装液量350L。3.菌株SC-2发酵液抗MRSA活性提取物的制备工艺:采用纳滤膜浓缩初步确定了SC-2发酵液中主要活性成分的分子量（200-1000）;筛选出HP20大孔吸附树脂对SC-2膜浓缩液进行脱色,参数为:上样量7BV,吸附流速2BV/h,再生溶剂为50%乙醇盐酸溶液（2%HCI）;筛选出AmberliteXAD16N大孔吸附树脂提取菌株SC-2所产活性物质的工艺参数:吸附量3.5BV,吸附流速为1BV/h,洗脱溶剂为20%乙醇溶液,洗脱体积3.5BV,洗脱流速1BV/h;最后用75%乙醇沉淀去除杂质。整个工艺简单,去杂率达到80%,最终粗提物的抗菌活性与同浓度的万古霉素相当。4.采用硅胶柱层析梯度洗脱收集活性组分,然后经过Sephadex G-10过滤,最终利用HPLC制备得到一肽类抗MRSA活性成分G2-Ⅱ,纯度大于95%。化合物G2-Ⅱ通过质谱、氨基酸N端测序、氨基酸组成分析,并与相关文献报道产物比较,初步确定该化合物是由Ala-Lys-APPA组成的分子量为376.3的三肽化合物,分子式为C14H25N4O6P。5.建立了HPLC法测定发酵液中活性化合物G2-Ⅱ含量的方法,色谱条件:Welchrom LP-C18（250mm×4.6mm,5um）,流动相甲醇-水（1:99→3:97,0-30min）,流速0.8 mL/min,检测波长204nm,进样量10u L,柱温为25℃。结果显示,化合物G2-Ⅱ在5.0μg5.0μg范围内线性关系良好,回归方程为Y=2E+06x+870660,r=0.9996;采用该方法测定出菌株SC-2发酵液中活性化合物G2-Ⅱ的含量约为0.90～0.93mg/L。6.化合物G2-Ⅱ对耐药金黄色葡萄球菌、耐药鲍曼不动杆菌、痤疮丙酸杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌、幽门螺杆菌、白色念珠菌、马拉色菌等常见致病菌都具有良好的拮抗作用,其抗菌谱较广。G2-Ⅱ对MRSA的MIC值为8μg/m L,优于万古霉素的16μg/m L;化合物G2-Ⅱ在浓度为32μg/m L-3mg/m L之间对多重耐药性金黄色葡萄球菌的抗菌活性随着药品浓度的增加而提高,并且在各浓度的抑菌活性都明显优于阳性药物万古霉素。