兔大型艾美耳球虫感染调查及其潍坊株分离鉴定与早熟选育研究
作者单位：华南农业大学
学位级别：硕士
导师姓名：林瑞庆
授予年度：2016年
学科分类：090603[农学-临床兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学]
摘 要：兔球虫病是由孢子虫纲真球虫目艾美耳科艾美耳属的一种或几种艾美耳球虫引起的一种以腹泻为主要症状的疾病,病原寄生于家兔肝脏或肠上皮细胞内。其中,大型艾美耳球虫是导致该病发生的主要虫种之一,该球虫具有传染性广和致病力强等特点,严重阻碍了养兔业的发展进程。当前,我国防控兔球虫病主要使用抗球虫药,长期及不当的药物使用导致了耐药虫株和药物残留等问题的出现,一方面危及人体的健康,另一方面使得药物防治兔球虫病的弊端日益突显起来。国内外对禽球虫病免疫预防方面的研究取得了较大的成果,国内已经有了商品化鸡球虫疫苗的生产和使用,但兔球虫疫苗目前在国内研究的人很少,商品化的兔球虫疫苗在市场上更没有出现和使用。本论文第一部分研究内容是广东、广西和山东部分地区兔大型艾美耳球虫流行病学调查。分别采集潍坊、佛山、河源、阳春、玉林、桂林、南宁7个地区9个不同规模、不同品种及不同年龄段的936份新鲜兔粪便样品,然后对采集的粪便样品应用饱和盐水漂浮法检测其中有无卵囊的存在,并通过卵囊形态学去判断兔球虫卵囊的类型。结果显示,感染大型艾美耳球虫的阳性样品所占比例为33.11%(310/936);不同地区中,玉林地区的感染率最高达到40.06%,南宁地区感染率最低为12.00%,其他地区感染率均超过20%;在不同年龄阶段中,幼兔的染率最高为60.00%,青年兔的感染率次之为29.82%,种兔的感染率最低为9.52%;不同养殖规模中,规模化大型养殖场的兔大型艾美耳球虫感染率最低为26.59%,中型和小型散养户的兔大型艾美耳球虫感染率则较高,分别为27.94%和40.28%;在不同品种中,伊拉兔的感染率最高为40.06%,比利时兔的感染率最低为12.00%,其他品种兔大型艾美耳球虫的感染率均超过25%。本论文第二部分研究内容是进行兔大型艾美耳球虫潍坊株的单卵囊分离及其基本生物学特性的研究。应用琼脂薄膜法进行兔球虫单卵囊分离,从含混合球虫卵囊的新鲜粪便中分离出大型艾美耳球虫卵囊,纯化后接种无球虫兔进行继代增殖。参照Oliveira发表设计的兔大型艾美耳球虫18s DNA序列,合成引物后对所提取的DNA进行扩增,之后进行测序比对。结果显示,所分离纯化的球虫卵囊为大型艾美耳球虫纯种虫株。对其部分生物学特性的研究结果表明:大型艾美耳球虫的潜隐期为14042 h,孢子化时间最早为32 h,80%的卵囊完成孢子化所需要时间为45 h;随机测量100个孢子化卵囊后发现其平均大小为35.76μm×21.91μm,形态指数为1.63。为测定其繁殖力,以500、1000和3000个孢子化卵囊经口分别接种40日龄无球虫兔,结果显示其繁殖能力随接种剂量的增大呈减小趋势;大型艾美耳球虫具有较强的致病性,分别以1万、3万、5万个孢子化卵囊的剂量接种40日龄无球虫兔,结果显示,三组兔子均出现精神沉郁、食欲减退、腹泻等现象。剖检可见空肠和回肠均有病变,接种3万和5万剂量组兔肠道浆膜层明显充血,肠腔明显扩张,且肠壁变薄,剪开肠道可见大量黏液样物质,且有纽扣样坏死出现,用盖玻片刮取病变肠壁黏膜,放置于显微镜下观察,可见大量裂殖体。本论文第三部分研究内容是对兔大型艾美耳球虫进行早熟选育,之后测定早熟株的潜隐期、卵囊大小、致病性以及其稳定性,同时设置亲本株试验组进行对照。经过连续27代的早熟选育后,早熟株的潜隐期由亲本株的142 h缩短至130 h,卵囊平均大小为34.41μm×21.13μm,形态指数为1.63;从临床症状及增重情况进行致病性的对比,早熟株的致病性要小于亲本株;排卵高峰期上,早熟株出现在第8天,较亲本株的第9天提前一天,且早熟株排卵高峰期峰值低于亲本株。本论文在国内第一次对兔大型艾美耳球虫进行早熟株的选育,并对其基本生物学特性做了系统的研究,这些都为后续兔球虫疫苗的研发奠定了基础。
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