壳聚糖内切酶基因在毕赤酵母中的高效表达

作     者：阳丽 

作者单位：江西师范大学 

学位级别：硕士

导师姓名：王曼莹

授予年度：2010年

学科分类：0710[理学-生物学] 07[理学] 08[工学] 09[农学] 071007[理学-遗传学] 0901[农学-作物学] 0836[工学-生物工程] 090102[农学-作物遗传育种] 

主      题：壳聚糖内切酶 毕赤酵母 酶活性 高效表达 

摘      要：本文以烟曲霉(Aspergillus fumigatus)分泌的壳聚糖内切酶为研究对象,将其成熟基因成功克隆后,经电转化导入毕赤酵母中实现高效表达。 壳聚糖内切酶是专一性降解壳聚糖生成水溶性壳聚糖与壳寡糖的最理想的生物催化剂,是替代当前普遍采用强酸等化学降解工艺的急需工业酶。 为了实现其高效表达,本文对几个关键问题进行研究,特别注重重组毕赤酵母发酵条件的优化,获得的研究资料为壳聚糖内切酶的生产提供了依据。 第一,研究了壳聚糖内切酶基因电转化到毕赤酵母中的最佳方式。确定了重组毕赤酵母表达载体pPIC9K-Csn经Sa1I线性化后电转化入表达宿主GS115。 第二,研究了多重组子的筛选。采用不同浓度的抗生素G418筛选多重组子,发现在4mg/mL的G418中筛选多重组子效果较好。经PCR分析后表明,壳聚糖内切酶基因在GS115中得到了正确的高效表达。经酶活检测,实验室摇瓶发酵时,多重组子在毕赤酵母中表达的酶活最高可达67.93U/mL。经SDS-PAGE测定,表达产物的分子量为25KD。 第三,对重组毕赤酵母发酵条件进行了优化。经过两个发酵阶段的条件优化实验:(1)生长阶段的最佳发酵工艺为:甘油1.0%(v/v),硫酸铵2.5%(w/v),Biotin 0.00004%(w/v),lmol/L磷酸缓冲液10%(v/v),pH5.5,在250mL的三角瓶里装液量为20mL,在30℃,220rpm条件下培养48h,接种量为1%。(2)诱导阶段的最佳发酵工艺为:甲醇0.5%(v/v),甘油0.25%(v/v),硫酸铵2.0%(w/v),Biotin 0.00004%(w/v),lmol/L磷酸缓冲液10%(v/v),pH6.0,在250mL的三角瓶里装液量为20mL,每隔24h补加一次初始浓度的甲醇和甘油,在30℃,220rpm条件下诱导培养48h,接种比率为1:l。验证实验表明,建立高密发酵生产条件,可获得更为理想的表达效果。在最佳发酵条件下,壳聚糖内切酶产量平均可达107.07U/mL。 以上研究结果表明,本研究构建的基因工程菌在毕赤酵母中成功表达,并筛选出多重组子。实验室摇瓶发酵时,酶活可达67.93U/mL。在高密发酵生产条件下,可获得更为理想的表达效果。因此该工程菌所产的壳聚糖内切酶有广阔的工业化生产和应用前景。