转染TDP-25对SH-SY5Y细胞自噬蛋白表达及细胞活力、凋亡的影响

作     者：周玉帅 

作者单位：郑州大学 

学位级别：硕士

导师姓名：滕军放

授予年度：2015年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100204[医学-神经病学] 10[医学] 

主      题：TDP-25 自噬 肌萎缩侧索硬化 额颞叶变性 

摘      要：背景肌萎缩性侧索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis,ALS)是一种最常见且致命的运动神经元疾病,主要表现为进行性肌无力、肌萎缩等,目前仍无有效的治疗方案,最终常因呼吸衰竭或肺部感染而死亡,从发现临床症状起,平均生存期一般为2-4年,10年的生存期的患者只占5-10%[1,2]。额颞叶变性(frontotemporal lobar degeneration,FTLD)是一种较为常见的痴呆性疾病,主要以行为异常、运动障碍和言语障碍等临床症状为主,绝大数患者发病年龄在45-65岁之间,病程2-20年之间不等,平均8年左右,目前本病仍无法治愈[3-5]。两者的临床症状和病理特点具有一定的重叠性,说明它们可能是同一种神经系统变性疾病,只是选择性地影响不同的易感神经元[6]。Neumann等[7]人研究发现大多数ALS和FTLD-TDP患者脑组织中存在TDP-43阳性包涵体,主要成分为泛素化、磷酸化的TDP-43及其截断型片段(TDP-25和TDP-35),然而关于TDP-25的报道很少,它如何参与ALS和FTLD的发病机制仍不清楚。目的探讨TDP-43截断型片段TDP-25对细胞自噬相关蛋白表达及细胞活力、凋亡的影响。方法分别转染GFP-N1、GFP-TDP-43和GFP-TDP-25三种质粒的神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y分为三组,24h后应用免疫荧光法检测包涵体的存在及其分布;应用Western blot实验检测蛋白LC3、Beclin-1的表达情况;将SH-SY5Y细胞转染质粒GFP-TDP-25后分为两组,一组加入3-MA自噬抑制剂,另一组不做处理,MTT比色法检测细胞活力;Annexin-V-FITC/PI检测细胞凋亡情况。结果***-N1组细胞核、胞质中均可见绿色荧光信号;GFP-TDP-43组绿色荧光信号主要分布于细胞核,未见明显的TDP-43向胞质中异位,且未见明显的包涵体形成;GFP-TDP-25组较强的绿色荧光信号呈颗粒状分布于细胞质,形成了包涵体;2.与GFP-N1组和GFP-TDP-43组相比,GFP-TDP-25组细胞中蛋白Beclin-1表达上调,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值升高,差异具有统计学意义(P0.05);3.与未加入3-MA组相比,加入3-MA后,过表达TDP-25细胞的细胞活力降低、细胞凋亡率增高,差异具有统计学意义(P0.05)。结论截短型片段TDP-25能够在细胞中形成包涵体,过表达TDP-25通过诱导细胞自噬水平上调来减弱其对细胞损害。调控自噬水平对肌萎缩性侧索硬化症和额颞叶变性患者病情进展可能起到一定延缓作用。