关中奶山羊乳腺中G蛋白偶联受体30和表皮生长因子受体的表达及相关性研究

作     者：于得水 

作者单位：西北农林科技大学 

学位级别：硕士

导师姓名：赵慧英

授予年度：2016年

学科分类：0905[农学-畜牧学] 09[农学] 

主      题：奶山羊乳腺 G蛋白偶联受体30 表皮生长因子受体 免疫组织化学 实时荧光定量PCR 

摘      要：已证实雌激素在哺乳动物妊娠、乳腺发育、泌乳启动与维持等方面发挥着重要的作用,雌激素的这些效应的发挥主要通过与其经典的核受体及膜受体结合而实现。G蛋白偶联受体30（G protein-coupled receptor 30,GPR30）作为一种新发现的雌激素膜受体,最先发现其与乳腺癌、卵巢癌等癌症的发生和发展密切相关,后续的研究证实它参与雌激素介导的诸多生殖生理功能的调节。研究发现GPR30在人和小鼠乳腺癌细胞中分布并促进和增强乳腺癌细胞的增殖活性,而GPR30在奶山羊等奶畜的乳腺组织中的形态学和功能方面的基础研究资料还未见报道。表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor,EGFR）可促进乳腺细胞的增殖分化,并在GPR30介导雌激素的信号转导通路中发挥着重要的调节作用。因此,本试验分别采集妊娠初期、妊娠中期、妊娠后期以及泌乳初期、盛乳期、泌乳中期和泌乳后期的关中奶山羊乳腺组织,分别运用免疫组织化学和实时荧光定量PCR法对乳腺中GPR30与EGFR的分布和表达及相关性进行了研究。获得了以下研究结果:1妊娠期和泌乳期关中奶山羊乳腺中GPR30与EGFR的免疫组化定位与表达GPR30免疫反应阳性产物均分布于妊娠和泌乳各阶段奶山羊乳腺组织的腔上皮细胞与肌上皮细胞的细胞质与细胞膜;除妊娠初期和泌乳后期仅少量上皮细胞表现GPR30阳性染色外,其他各阶段的乳腺组织中几乎全部上皮细胞均有GPR30免疫阳性产物分布。乳腺中GPR30的相对表达量从妊娠初期到妊娠后期逐渐升高并达峰值,泌乳期则逐渐下降至泌乳后期的最低;GPR30的相对表达量在妊娠中期后半段极显著升高（P0.01）,妊娠后期仍有升高但差异不显著（P0.05）;泌乳初期GPR30的相对表达量显著低于妊娠后期（P0.05）,而高于盛乳期（P0.05）,其后表达水平极显著下降（P0.01）并降到最低水平。EGFR免疫反应阳性产物亦分布于妊娠和泌乳各阶段奶山羊乳腺组织的腔上皮细胞与肌上皮细胞的细胞质与细胞膜;泌乳中期和泌乳后期这2阶段只有部分上皮细胞有EGFR免疫染色,其他各阶段的乳腺组织中几乎全部上皮细胞均有EGFR免疫阳性产物分布。EGFR的表达水平表现为妊娠期时逐渐升高并在妊娠后期时达到峰值,泌乳期逐渐下降在泌乳后期降到最低;EGFR的相对表达量在妊娠后期与泌乳前期这2个阶段最高,且妊娠后期极显著高于泌乳前期（P0.01）。GPR30与EGFR的免疫组化结果的相关系数r=0.884,呈显著性正相关,即妊娠期和泌乳期各阶段GPR30和EGFR的相对表达量呈一致性的变化规律。2 GPR30 mRNA和EGFR mRNA的相对表达量检测RT-PCR结果显示GPR30 mRNA和EGFR mRNA的相对表达量与二者蛋白的表达趋势相似,同样均呈先升高再降低的表达趋势。GPR30 mRNA的相对表达量在妊娠后期和泌乳初期时最高且均极显著高于其他阶段（P0.01）;而EGFR mRNA在妊娠后期、泌乳前期和盛乳期均有高表达且极显著高于其他阶段（P0.01）,其中妊娠后期表达量最高但与泌乳前期差异不显著（P0.05）,盛乳期极显著低于泌乳前期（P0.01）。GPR30 mRNA与EGFR mRNA相对表达量的相关系数r=0.835,呈显著性正相关,即妊娠期和泌乳期各阶段GPR30 mRNA与EGFR mRNA的相对表达量呈一致性的变化规律。以上结果表明,GPR30和EGFR主要分布于奶山羊乳腺的腔上皮和肌上皮细胞,其蛋白和mRNA的相对表达量随妊娠天数逐渐升至最高、随泌乳天数逐渐降低,且二者呈显著正相关,提示GPR30和EGFR共同参与了妊娠期和泌乳期奶山羊乳腺的生长发育和功能变化的调节。