新蚜虫疠霉（虫霉目）共生细菌多样性研究
作者单位：中国计量学院
学位级别：硕士
导师姓名：陈春
授予年度：2014年
主 题：虫霉目真菌 新蚜虫疠霉 共生细菌 荧光原位杂交 16SrRNA基因文库
摘 要：与共生细菌相关的科学研究受到越来越多的关注，大量证据显示在农林环境、食品药物等领域的诸多科学问题都与细菌和真菌的互作有非常密切的关系。而且细菌与真菌共生不是一种偶然的生态现象，而是经历了长期的协同共进化，最终两者能够相互适应和相互依存，这样的科学观点得到许多学者的认同。 虫霉目(Entomophthorales)真菌是许多昆虫的专性病原真菌，通过引起寄主高强度的流行病而达到控制害虫的作用，是重要的生防真菌和科学研究对象。然而虫霉目昆虫病原真菌是否存在共生细菌这一观点一直没有得到关注和科学的证明，本文从虫霉目真菌是否存在共生菌这个假设出发，以在蚜群中广泛流行的专性病原真菌新蚜虫疠霉（Pandora neoaphidis）为研究对象，通过16S rRNA技术构建基因文库，获得新蚜虫疠霉共生细菌的种群多样性信息，同时通过常规方法对可培养共生菌进行分离、鉴定来确定共生菌的种类，运用荧光原位杂交技术（FISH）确定共生菌在新蚜虫疠霉菌丝中的位置;通过对不同来源虫霉样品的共生细菌进行16S rRNA基因文库构建，来验证细菌共生在虫霉目真菌中的普遍性;另外通过生物测定来验证共生细菌的多样性与新蚜虫疠霉对桃蚜毒力的相关性，为研究共生细菌和虫霉目真菌的互作机制提供新的思路。一、新蚜虫疠霉共生细菌16S rRNA基因文库构建 通过构建新蚜虫疠霉共生细菌16S rRNA基因文库，共获得9个种属的细菌，这些共生细菌主要隶属于Proteobacteria变形菌门，其中比例最高的为γ-变形菌纲共占了62.0%，α-变形菌纲和β-变形菌纲分别为14.3%和2.4%，同时硬壁菌门Firmicutes和拟杆菌门Bacteroidetes分别占了4.8%和16.7%。在这些共生菌群中，不动杆菌属以42.9%的比例为最高。由此确定了新蚜虫疠霉存在共生细菌的假设，且这些共生细菌具有比较丰富的种群多态性。二、新蚜虫疠霉共生细菌的分离、鉴定和荧光原位杂交验证 通过对新蚜虫疠霉液体菌丝中共生细菌在常规培养基上进行分离和培养，获得了一株可培养的新蚜虫疠霉共生细菌，对该共生细菌进行16S rRNA和Biolog生理生化鉴定，初步确定该共生细菌为醋酸钙不动杆菌（Acinetobactercalcoaceticus），而且以新蚜虫疠霉总DNA作为模板，用不动杆菌特异性引物P-rA1和P-rA2进行扩增，同样获得了425bp的具有特异性的目的条带，这与我们前面16S rRNA基因文库构建中的结果相符。根据获得的共生细菌16S序列设计特异性的杂交探针，对新蚜虫疠霉菌丝切片进行荧光原位杂交，激光共聚焦显微镜观察后获取的图像可以明显地证明共生细菌不动杆菌（A. calcoaceticus）存在于新蚜虫疠霉菌丝体内，确定了不动杆菌是新蚜虫疠霉中可培养的内共生细菌之一。 三、不同虫霉样品共生细菌16S rRNA基因文库构建及其相关功能分析 分别对不同地域寄主来源的新蚜虫疠霉ARSEF5403菌株、努利虫疠霉ARSEF8931菌株，分离过程中未经抗生素处理的F98028菌株和经PSN抗生素处理的新蚜虫疠霉F98028+菌株及其分生孢子F98028+pc进行共生细菌的16SrRNA基因文库构建，总共获得了21个属的25种共生细菌。通过对不同样品中共生细菌之间的种群关系进化分析发现，它们分别属于Alphaproteobacteria、Betaproteobacteria、 Gammaproteobacteria、 Firmicutes、 Actinobacteria以及Bacteroidetes共六个系统类群。上述研究表明细菌共生现象在虫疠霉属的真菌中普遍存在，而且具有较高的多样性。 在比较新蚜虫疠霉菌株F98028+及其分生孢子的共生菌群后发现，新蚜虫疠霉可以将部分类群的共生细菌垂直传播至其弹射的分生孢子中。 在新蚜虫疠霉F98028复壮分离时，通过分析使用PSN抗生素对共生菌群的影响发现，γ-变形菌纲对抗生素具有很强的抗性。分别对新蚜虫疠霉F98028+菌株（分离时使用抗生素）和复壮后的新蚜虫疠霉F98028菌株（分离时未使用抗生素）进行生测，结果发现，前者的LC50值显著高于后者，说明新蚜虫疠霉在经过复壮后对寄主桃蚜的毒力呈上升趋势;而且共生菌群的多样性指数也和毒力成正相关。可能是由于新蚜虫疠霉中的一部分共生细菌需要通过对蚜虫寄主的侵染而获得，进而恢复因传代或者抗生素处理而减弱的毒力。 四、结论与意义 本研究通过对重要的虫霉目真菌—新蚜虫疠霉的共生细菌现象进行了系统的研究，上述的研究结果表明，新蚜虫疠霉存在共生细菌这一假设成立，而且在虫霉目真菌中具有一定的共生普适性。这一发现将对深入研究虫霉目真菌生物学功能的内在机制提供了一条崭新的思路。
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