应用siRNA技术抑制产肠毒素大肠杆菌LT基因表达的研究

作     者：付瑞 

作者单位：昆明医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：段勇

授予年度：2013年

学科分类：1007[医学-药学(可授医学、理学学位)] 100705[医学-微生物与生化药学] 1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 100103[医学-病原生物学] 10[医学] 

主      题：产肠毒素大肠杆菌 不耐热肠毒素 siRNA技术 RNA干扰 

摘      要：目的应用siRNA技术抑制产肠毒素大肠杆菌(ETEC) LT基因的表达。 方法针对LT基因设计siRNA序列,采用体外合成法合成。绘制ETEC的时间-OD600值曲线,判断ETEC的对数生长期。建立OD600值-活菌数回归方程,判断菌液中ETEC的数量。在ETEC培养过程中,将针对LT的siRNA、非特异性对照siRNA、阴性对照siRNA和培养基分别加入siRNA组、非特异性对照siRNA (siRNA-coa3)组、阴性对照siRNA (siRNA-NC)组和空白对照(Blank)组,分3个时间点加入,每次1nmol。在首次加入siRNA后45min(A组)、90min(B组)、135min (C组)留取菌液,应用实时荧光定量PCR检测上述3个时间点5组(siRNA-LT1组、siRNA-LT2组、siRNA-coa3组、siRNA-NC组和Blank组)LT mRNA的表达水平。应用Western Blot检测siRNA-LT1组、siRNA-LT2组和Blank组在3个时间点LT蛋白表达的水平。 结果根据绘制的时间-OD600值曲线,判断OD600值在0.192～0.791期间为ETEC的对数生长期。建立的OD600值-活菌数回归方程为：y=0.23+1.31x(R2=0.96),OD600值(x),活菌数目(y×109)/ml。实时荧光定量PCR结果显示,在A组、B组和C组,siRNA-LT1组和siRNA-LT2组的LT mRNA的表达量均低于Blank组(P0.05)。Western Blot结果显示,siRNA-LT1组和siRNA LT2组分别与Blank组相比,在3个时间点LT蛋白的表达均有所降低,在45min时siRNA-LT1对LT蛋白表达的抑制率达43%,此时siRNA分子数与细菌数之比约为4.76×105：1。 结论针对LT基因设计合成的siRNA在体外能有效的抑制LT基因的表达,筛选出2对有效的siRNA序列。