儿童急性髓性白血病患者骨髓基质细胞分泌IL-8促进白血病细胞株（HL-60）增殖的研究

作     者：施璐 

作者单位：新乡医学院 

学位级别：硕士

导师姓名：许建文

授予年度：2017年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：急性髓性白血病 骨髓基质细胞 白介素-8 白介素-8抗体 细胞增殖 

摘      要：背景急性髓性白血病(Acute myeloid leukemia,AML)患者目前缺乏特效治疗药物,尤其是儿童期患者,病情进展迅速、死亡率极高。即使通过化学治疗达到缓解,AML患者常因隐藏在骨髓微环境中微小残留病灶而再次复发。再者,原代AML细胞在体外条件下易出现自发性凋亡,而在机体内可大量增殖。上述均证明骨髓基质细胞对AML细胞增殖极其重要。IL-8是一种多细胞源性促炎因子,它在多种肿瘤患者体内高表达,与肿瘤的发生发展有着密切关系。国外已有文献报道,骨髓基质细胞能分泌多种细胞因子,包括IL-8。骨髓基质细胞是否分泌IL-8,IL-8是否够能促进白血病细胞增殖等问题国内较少报道。本实验拟采用白血病细胞株(HL-60)为模型,分离AML儿童患者骨髓基质细胞(Bone marrow stromal cell,BM-MCS),通过采用共培养体系,采用ELISA法检测共培养体系上清IL-8含量、MTT法检测HL-60细胞增殖、流式细胞术检测HL-60细胞凋亡率、免疫荧光检测凋亡蛋白bax表达,进而探讨BM-MCS细胞能分泌IL-8促进HL-60细胞增殖,并通过IL-8抗体阻断加以验证。实验有助于阐明骨髓基质微环境对白血病发病的作用机制,为临床儿童AML的免疫治疗提供理论依据。目的本实验拟采用白血病细胞株(HL-60)为模型,分离AML儿童患者骨髓基质细胞,验证AML患者骨髓基质细胞能分泌IL-8促进白血病细胞株(HL-60)增殖,阐明骨髓基质微环境对白血病发病的作用机制,为临床儿童AML的免疫治疗提供理论依据。方法***-8刺激HL-60细胞增殖检测:分别采用不同浓度梯度包括1ng/ml、2ng/ml、4ng/ml、8ng/ml浓度IL-8刺激HL-60细胞,24h后观察细胞形态,并用MTT法检测细胞增殖情况。2.密度梯度离心法分选临床儿童AML患者骨髓基质细胞。3.骨髓基质细胞与HL-60共培养,ELISA法检测培养上清IL-8含量。4.骨髓基质细胞与HL-60共培养,MTT法检测HL-60细胞增殖情况,并分析HL-60增殖与IL-8含量的相关性;5.骨髓基质细胞与HL-60共培养,给予IL-8抗体中和上清IL-8,采用流式细胞术检测HL-60细胞凋亡。6.骨髓基质细胞与HL-60共培养,给予IL-8抗体中和上清IL-8,采用免疫荧光结合激光共聚焦检测凋亡蛋白bax表达。7.统计学方法:计量数据以均数加减标准差表示,两组间差异比较采用t检验。检验水准α=0.05,P0.05为差异有统计学意义。结果***-8刺激HL-60细胞增殖:采用不同浓度梯度包括1ng/ml、2ng/ml、4ng/ml、8ng/ml浓度IL-8刺激HL-60细胞,在IL-8浓度小于等于4 ng/ml时,随着IL-8浓度的增加,HL-60细胞增殖率不断增高,当IL-8浓度继续增加,HL-60细胞增殖率到达平台期,增殖增加不明显。***-MCS细胞分泌IL-8:BM-MSC和HL-60细胞共培养,ELISA法检测培养上清IL-8浓度为(3.83±2.22)ng/ml,空白对照组培养上清IL-8含量为(0.68±0.11)ng/ml,前者显著高于后者,且有统计学差异。***-MCS细胞分泌IL-8刺激HL-60细胞增殖:BM-MSC和HL-60细胞共培养,MTT法检HL-60细胞OD值为(15.16±2.03),空白对照组HL-60细胞OD值为(10.62±0.90),前者高于后者且有统计学差异。共培养体系上清IL-8含量与HL-60细胞增殖存在明显正相关(R2=0.7673;P=0.0002)。***-8抗体促进共培养体系中HL-60细胞凋亡:在BM-MSC和HL-60细胞共培养体系中加入IL-8抗体,流式细胞术检测HL-60细胞凋亡率为(8.41±1.70)%,未加入IL-8抗体共培养体系HL-60细胞凋亡率为(2.00±0.59)%,前者凋亡率高于后者且有统计学差异。***-8抗体促进共培养体系中HL-60细胞凋亡蛋白bax的表达:在BM-MSC和HL-60细胞共培养体系中加入IL-8抗体,免疫荧光结合激光共聚焦法检测HL-60细胞凋亡蛋白bax表达,发现bax表达呈现红色大颗粒状或小块状,说明该组HL-60细胞凋亡明显;未加入IL-8抗体共培养体系HL-60细胞bax表达呈现微粒状或粉尘状,说明该组HL-60凋亡发生相对较少。结论***-8能刺激白血病细胞(HL-60)增殖,增殖率呈现浓度依赖性。2.儿童AML患者BM-MSC细胞能分泌IL-8,刺激HL-60细胞增殖,增殖率与IL-8浓度呈正相关。***-8抗体通过中和儿童AML患者BM-MSC细胞分泌的IL-8,进而促进HL-60细胞凋亡,促进其凋亡蛋白bax表达。