相似穿孔线虫拮抗细菌筛选与鉴定及其发酵液稳定性

作     者：朱莲英 

作者单位：海南大学 

学位级别：硕士

导师姓名：陈绵才

授予年度：2013年

学科分类：09[农学] 0904[农学-植物保护] 090401[农学-植物病理学] 090402[农学-农业昆虫与害虫防治] 

主      题：相似穿孔线虫 拮抗细菌 洋葱伯克氏菌 发酵上清液 稳定性 

摘      要：相似穿孔线虫[Radopholus similis (Cobbl893) Thorne,1949]又名香蕉相似穿孔线虫,是一种非常重要的检疫性有害生物,寄主范围广,具有毁灭性危害,已给我国农业生产构成潜在威胁。由于目前使用的化学杀线剂的毒性大多较高,筛选和获得对其具有拮抗活性的微生物菌株并加以利用,对实施防控具有重要现实意义。本研究从感病香蕉根际取样,筛选、鉴定对香蕉相似穿孔线虫有毒杀活性的拮抗菌株,并对拮抗菌株发酵液稳定性进行初步研究。旨在了解根际微生物与相似穿孔线虫之间的互作关系,为新型杀线剂的开发提供技术支持。具体研究结果如下： (1)从感染相似穿孔线虫的香蕉根际土壤采集土样样品39份,从中共分离到789株细菌。经室内生物测定,发现5株细菌(编号HD-34、HD-46、HD-54、HD-86和HD-93)其菌株发酵上清液处理后24h内对相似穿孔线虫幼虫的致死率均达90%以上,在48h内致死率达100%。温室盆栽试验结果表明,5个菌株发酵上清液处理后42-70d内,对相似穿孔线虫的防治效果均呈上升态势,而阿维菌素的防治效果却明显下降。其中HD-86处理表现最好,在接种菌株HD-86发酵上清液42d和70d的相对防治效果分别达77.34%和90.51%,阿维菌素处理70d的防效仅63.97%;与空白对照相比,拮抗细菌处理的香蕉植株株高、茎直径和根重均明显增加。通过室内生测及温室盆栽试验筛选出5株能高效杀死相似穿孔线虫的拮抗细菌菌株。 (2)分子生物学鉴定结果,***-54和HD-86均为伯克氏菌属Burkholderia,而HD-46和HD-93为肠杆菌属Enterobacter。将测定的拮抗菌株HD-86与已报道的16SrDNA序列进行比对,构建系统发育树,发现该菌株的序列与Burkholderia cepacia isolate MSMB10单独构成一个分支,将其鉴定为洋葱伯克氏菌Burkholderia cepacia。 (3)由于洋葱伯克霍尔德氏菌致病因子(BCESM)毒力基因与人体致病基因相关,利用PCR特异性引物检测了菌株HD-86(Burkholderia cepacia)的毒性,结果未检测到该菌株中与人体致病相关的BCESM毒力基因,从而验证了其对人类和环境的安全性。 (4)菌株HD-86发酵上清液对相似穿孔线虫拮抗活性稳定性的研究结果表明,经80℃高温处理60min后其拮抗活性仍然极高,在pH为8-10的范围内随着碱性增强其拮抗性效果越好,紫外线处理对其拮抗活性没有影响。 (5)稀释10倍、50倍和500倍的菌株HD-86发酵上清液可促进绿豆的生长,其中稀释50倍处理的绿豆芽平均长度为18.12cm,株平均鲜重为0.45g。与清水空白对照相比,长度平均增长2.44cm,株平均鲜重增加0.15g,均达到差异显著或极显著水平,以稀释50倍处理的促生作用最明显。但是,菌株HD-86发酵上清原液对绿豆幼苗生长有明显的抑制作用。 (6)通过有机溶剂萃取菌株发酵液测试对相似穿孔线虫的活性发现,乙酸乙酯提取物对相似穿孔线虫具有较强的杀线虫活性。处理24h和48h后,其对相似穿孔线虫的LC50分别为5.74mg/mL和2.74mg/mL.