MiR-4521水平降低负向激活FAM129A促进CML进展及作用机制研究

作     者：郑善亮 

作者单位：大连医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：孙明忠

授予年度：2017年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：慢性粒细胞白血病 miR-4521 FAM129A 分子机制 

摘      要：背景:慢性粒细胞白血病(Chronic Myeloid Leukemia,CML)是来源于多能造血干细胞的一种恶性增殖性疾病,具有高度增生和恶性侵袭的生物学特性。约占成年人白血病的20%。大部分CML患者都会出现Ph染色体的特异细胞遗传学改变,即9号染色体长臂上ABL原癌基因易位至22号染色体长臂的断裂点簇集区(BCR)形成BCR-ABL融合基因。该蛋白具有持续激活酪氨酸激酶活性,BCR-ABL酪氨酸激酶可激活下游信号通路促进细胞持续增殖、增强细胞迁移、影响细胞正常凋亡、阻断细胞分化,引起CML。miR-4521异常表达与多种癌症密切相关。FAM129A高表达与多种恶性肿瘤发生发展相关,FAM129A下调能够抑制甲状腺癌细胞增殖,迁移,侵袭及凋亡。但二者在CML进展及K562细胞恶性行为的研究尚无报道。目的:1.研究CML患者骨髓样本中miR-4521,FAM129A表达及二者相关性;2.探讨miR-4521与FAM129A间靶向负调控关系;3.研究miR-4521上调对K562生物学行为影响及分子机制;4.研究FAM129A下调对K562生物学行为影响及分子机制;方法:***-PCR法检测miR-4521,FAM129A在33例人初发CML样本,6例正常人样本,及7例非恶性白血病样本中表达情况,比较CML病人在初发及完全缓解(CR)情况下,miR-4521,FAM129A水平变化及相互间关系。2.通过miRNA预测软件(TargetScan,miRDB)分析miR-4521与FAM129A间靶向关系;psi-CHECKTM2.0-WT-FAM129A-3’UTR/psi-CHECKTM2.0-MUT-FAM129A-3’UTR表达载体构建;将重组双荧光素酶报告基因表达载体分别与miR-4521 mimic/NC mimic共转染至293T细胞中,检测双荧光素酶的活性值,验证靶向关系;3.利用LipofetaminTM 2000转染试剂,将miR-4521 mimic瞬时转染至K562中,qRT-PCR法检测miR-4521上调效率及FAM129A表达;WB法检测miR-4521上调对FAM129A表达影响;台盼蓝计数法检测miR-4521上调对K562增殖影响;Transwell小室法检测miR-4521上调对K562迁移,侵袭能力影响;qRT-PCR法检测miR-4521上调后,MMP-2,MMP-9,TIMP-1表达;4.利用LipofetaminTM 2000转染试剂,将si-FAM129A瞬时转染至K562中,用WB法检测FAM129A下调效率;台盼蓝计数法检测FAM129A下调对K562增殖影响;Transwell小室法检测FAM129A下调对K562迁移,侵袭能力影响,qRT-PCR法检测FAM129A下调后,MMP-2,MMP-9,TIMP-1表达;结果:1.与正常样本组相比,miR-4521呈现低表达,FAM129A呈现高表达,miR-4521,FAM129A在非恶性样本中表达无差异;在同一患者样本中,与初发CML样本相比,二者表达水平在CR阶段都出现“回复现象;初发CML样本中,miR-4521与FAM129A间表达水平负相关(P=0.0152,R2=0.2218);2.双荧光素酶报告基因实验表明,在MUT组中,NCmimic组与miR-4521mimic组的检测活性无明显差异,但WT组中,二者检测活性差异明显,与NC mimic相比,miR-4521mimic组的检测活性降低44%,P=0.0022;3.瞬时转染miR-4521 mimic后,K562增殖,迁移和侵袭能力均受到抑制,FAM129A基因和蛋白表达分别降低57.1%及蛋白水平降低41%,MMP-2,MMP-9基因表达均降低,TIMP-1表达升高;4.瞬时转染si-FAM129A后,K562增殖,迁移和侵袭能力均受到抑制,MMP-2,MMP-9基因表达降低,TIMP-1表达升高。结论:***-4521低表达,FAM129A高表达与CML发病正相关,CML病人治疗CR后,二者表达水平逆转回复;CML患者骨髓样本中,miR-4521和FAM129A水平显著负相关;***-4521通过结合FAM129A 3’UTR区靶向负调控FAM129A表达;***-4521上调能够明显抑制K562增殖,迁移,侵袭能力,降低MMP-2,MMP-9及升高TIMP-1表达;***129A下调能够明显抑制K562增殖,迁移,侵袭能力,降低MMP-2,MMP-9及升高TIMP-1表达;总之,miR-4521通过靶向负调控FAM129A表达,影响MMP-2,MMP-9,TIMP-1表达,进而影响K562细胞增殖,迁移,侵袭,以此影响CML发生,发展。