中药“脊髓康”对大鼠脊髓损伤神经元的保护作用及机制研究

作     者：潘娅岚 

作者单位：南京中医药大学 

学位级别：硕士

导师姓名：马勇

授予年度：2015年

学科分类：1006[医学-中西医结合] 10[医学] 100602[医学-中西医结合临床] 

主      题：脊髓康 脊髓损伤 神经元 细胞凋亡 含药血清 

摘      要：背景：脊髓损伤(Spinal Cord Injury, SCI)是脊柱疾病和脊柱损伤的严重并发症,中医药具备的多因素、多靶点作用的优点,正逐步成为促进SCI后神经再生的研究热点。中药方“脊髓康是基于SCI“肾督虚损,瘀阻督脉,枢机统率失职病机特点,在“温肾督理论指导下组方而成的临床验方,大量前期研究已证实其促进SCI修复作用确切,而其具体干预机制尚不明确。目的：体外构建大鼠脊髓神经元凋亡模型,观察“脊髓康含药血清对损伤神经元的存及凋亡的影响,探讨“脊髓康抗脊髓损伤的可能作用机制。方法：体外分离培养鉴定大鼠脊髓神经元;制备谷氨酸诱导凋亡模型;以不同剂量中药方“脊髓康及强的松含药血清配制的完全培养基干预神经元损伤模型,通过形态学观察、CCK-8法、TUNEL法观察神经元的存活与凋亡,Western blot、qRT-PCR等分子生物学法检测凋亡指标bcl-2、bax及Caspase 3的表达。结果：(1)神经元存活情况：体外培养的脊髓神经元诱导凋亡后,大部分突触断裂回缩,部分胞核固缩、胞质出现空泡、胞体崩解;加入强的松及不同浓度的脊髓康含药血清培4后,神经元坏死的速率呈现不同程度地减慢。其中强的松组细胞存活最多,轮廓清晰完整,再生突触交织成网,实验1组细胞坏死崩解较多,存活细胞轮廓模糊、再生突触稀疏,验2、3组细胞存活较多,以实验3组细胞轮廓更清晰,折光强,存活细胞明显聚集生长。CCK-8结果显示,各组间细胞存活不全相同(P0.05)。(2)神经元的凋亡情况：神经元损伤后加入含药血清继续培养48h,模型组可见大凋亡神经元,仅少量存活,形态不规则;强的松组存活神经元较多,少量细胞凋亡;脊康低剂量组大量神经元呈核质深染,胞体轮廓不清;中剂量组较多神经元凋亡,存活神元排列紊乱,轮廓尚可见;高剂量组可见部分凋亡细胞,存活细胞突触明显,部分交织网状。高剂量组凋亡率低于阳性对照组和中剂量组,与模型组比较有统计学意义(P0.05)。(3) Western blot结果显示：各组神经元bcl-2、bax、Caspase 3蛋白相对表达水平全相同,表达高低依次为：bcl-2：高剂量组强的松组中剂量组低剂量组模组(P低剂量组中剂量组高剂量组强的松组(P高剂量组中剂量组低剂量组模型组(P低剂量组中剂量组强的松组高剂量组(P高剂量组中剂量组低剂量组(P中剂量组高剂量组强的松组(P0.05)。结论：(1)100μM的Glu在一定程度上模拟了SCI后体内神经元生存的微坏境,能够引起体外培养的脊髓神经元的凋亡,可用于制备SCI的细胞模型。(2)强的松及脊髓康中、高剂量血清均有利于损伤后神经元存活,存活细胞数量三组间比较差异无统计学意义,降低凋亡率方面脊髓康高剂量组优于其他干预组。(3)强的松以及脊髓康3个剂量均能够提高神经元bcl-2蛋白及mRNA的表达、抑制bax、 Caspase 3蛋白及mRNA的表达,并上调bcl-2/bax的比值;脊髓康3个剂量中高剂量作用更明显,在上调bcl-2蛋白、抑制Caspase 3蛋白表达略优于强的松组,其余指标均劣于强的松组但优于低中剂量组。结合神经元的存活率和凋亡率分析,推测脊髓康含药血清可能通过其他途径影响神经元的存活,或通过干预胶质细胞等间接影响神经元的凋亡或存活。