硫辛酸抑制2型糖尿病大鼠肾脏氧化应激及mTOR信号转导通路激活

作     者：季虹 

作者单位：河北医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：刘宽芝

授予年度：2017年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100210[医学-外科学(含：普外、骨外、泌尿外、胸心外、神外、整形、烧伤、野战外)] 100201[医学-内科学(含：心血管病、血液病、呼吸系病、消化系病、内分泌与代谢病、肾病、风湿病、传染病)] 10[医学] 

主      题：硫辛酸 雷帕霉素靶蛋白 腺苷酸活化蛋白激酶 8-羟基脱氧鸟嘌呤 糖尿病肾脏病 2型糖尿病 

摘      要：目的:糖尿病肾脏病(diabetic kidney disease,DKD)是2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)常见微血管并发症之一,并已成为导致患者终末期肾脏疾病甚至死亡的主要原因。DKD的发病机制尚未系统阐明,目前认为糖脂代谢紊乱、血流动力学改变、氧化应激、炎症反应、肾脏自噬抑制等与DKD发生发展有着密切联系,其中氧化应激是DKD重要发病机制,还可以介导炎症反应进一步加速肾脏损伤。8-羟基脱氧鸟嘌呤(8-hydroxy-2-deoxygnanosine,8-OHdG)是一种目前反映DNA氧化损伤及体内氧化应激的敏感指标。近年来,随着对雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)信号通路研究的逐渐深入,发现mTOR通路的激活促进肾脏细胞肥大、蛋白质合成增加,参与氧化应激、炎症反应并抑制肾脏细胞自噬,在局灶节段性肾小球硬化、膜性肾病等慢性肾脏疾病的发病中起重要作用。腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine5’-monophosphate-activate protein kinase,AMPK)是调控mTOR的上游信号之一,其主要通过抑制mTOR信号通路发挥作用。硫辛酸作为抗氧化剂,可以抑制氧自由基的生成,临床上用于糖尿病周围神经病变治疗收到了良好疗效,但对DKD有无作用尚不明确。本实验通过复制T2DM大鼠模型,测定各组大鼠肾脏中AMPK、p-AMPK、mTOR、p-mTOR的表达情况及体内8-OHdG水平,以探讨mTOR信号通路、氧化应激与T2DM肾脏病的关系及硫辛酸对肾脏mTOR信号通路及氧化应激的影响。方法:22只雄性清洁级Sprague-Dawley(SD)大鼠,鼠龄6周,体重为180g±20g,清洁级环境饲养。应用excel随机数字表法将大鼠随机分为正常对照组(NC组,n=6)、糖尿病组(DM组,n=8)、硫辛酸干预组(LA组,n=8)。正常对照组大鼠继续予以普通饲料喂养,其余两组大鼠予以高糖高脂饲料(蔗糖20%、猪油10%、胆固醇2.5%,胆酸盐1%,基础饲料66.5%)喂养。4周后,糖尿病组及硫辛酸干预组大鼠给予30mg/kg链脲佐菌素腹腔注射,正常组大鼠腹腔注射等体积柠檬酸缓冲液,注射2周后测定大鼠空腹血糖(fastingbloodglucose,fbg),fbg7.8mmol/l视为t2dm造模成功。随后硫辛酸干预组予以100mg/kg硫辛酸腹腔注射,正常对照组和糖尿病组均以等体积生理盐水腹腔注射,每日给药1次,连续给药8周。实验结束前一日收集各组大鼠24小时尿液,用于测定24小时尿蛋白;当日留取血清用于测定肾功能和8-ohdg等指标;取左肾称重后,4%多聚甲醛固定,行he染色和pas染色观察肾脏组织形态学变化,行masson染色观察肾脏组织纤维化情况。免疫组织化学染色法检测大鼠肾脏ampk、p-ampk、mtor、p-mtor的表达。结果:1各组大鼠体重及肾脏肥大指数的比较正常组大鼠体重为(455.17±22.46)g,肾脏肥大指数为(3.65±0.24)mg/g;糖尿病组大鼠体重为(250.67±26.56)g,肾脏肥大指数为(7.12±0.28)mg/g;硫辛酸组大鼠体重为(259.20±15.48)g,肾脏肥大指数为(6.10±0.45)mg/g。与正常组相比,糖尿病组和硫辛酸组大鼠体重减轻,肾脏肥大指数升高(p0.05)。2各组大鼠生化指标的比较正常组大鼠血糖为(5.17±0.71)mmol/l,尿蛋白为(15.27±1.45)mg/24h,血肌酐为(37.23±4.97)μmol/l,血尿素氮为(6.38±1.18)mmol/l;糖尿病组大鼠血糖为(21.38±1.66)mmol/l,尿蛋白为(314.00±16.14)mg/24h,血肌酐为(36.70±4.80)μmol/l,血尿素氮为(7.52±1.21)mmol/l;硫辛酸组大鼠血糖为(20.60±0.60)mmol/l,尿蛋白为(249.88±28.61)mg/24h,血肌酐(37.80±4.03)μmol/l,血尿素氮(7.76±1.24)mmol/l。与正常组相比,糖尿病组和硫辛酸组大鼠的血糖和24小时尿蛋白均显著升高(p0.05);与糖尿病组相比,硫辛酸组大鼠24小时尿蛋白降低(p0.05)。3各组大鼠8-ohdg的比较正常组大鼠8-ohdg为(1.63±0.62)ng/ml,糖尿病组大鼠8-ohdg为(5.09±0.89)ng/ml,