黑曲霉果糖基转移酶的异源表达及分子改造

作     者：郭文文 

作者单位：江南大学 

学位级别：硕士

导师姓名：陈献忠

授予年度：2016年

学科分类：081703[工学-生物化工] 08[工学] 0817[工学-化学工程与技术] 

主      题：果糖基转移酶 异源表达 催化效率 热稳定性 定点突变 融合表达 

摘      要：低聚果糖(FOS)因其能够调理肠道菌群、低甜度、低热量等生理功能,在食品等领域具有重要应用。果糖基转移酶可催化蔗糖生产低聚果糖。本文克隆了黑曲霉(Aspergillus niger)来源的果糖基转移酶基因并实现了在毕赤酵母(Pichia pastoris)的异源表达,通过发酵优化提高重组菌产酶水平并鉴定了重组酶的酶学性质。利用蛋白质工程手段改造果糖基转移酶分子,从而提高果糖基转移酶催化效率、热稳定性和FOS含量等。本研究主要结论如下:(1)采用RT-PCR技术,克隆来自A.niger SG610的果糖基转移酶cDNA序列,在P.pastoris GS115中实现异源表达。重组果糖基转移酶FruSG的最适温度为50℃,在40℃以下时酶稳定,最适pH为5.5,pH 3.0～8.0时稳定。重组酶FruSG的Km和kcat分别为214.13 g·L-1和63.33 s-1。当葡萄糖浓度为50 g·L-1和100 g·L-1时,重组酶FruSG的Ki分别为130.60 mmol·L-1和170.00 mmol·L-1。添加1 mmol·L-1的Fe2+或5mmol·L-1 Mg2+,重组酶FruSG酶活力增强。(2)对重组P.pastoris FruSG产果糖基转移酶进行发酵优化,摇瓶最佳产酶条件为:装液量为30 m L/250 m L、甘油:甲醇为1:20(v/v)、初始pH为5.5、诱导温度30℃、初始甲醇浓度为1.0%、甲醇浓度为1.5%、硫酸铵浓度为10 g·L-1。诱导120 h,重组果糖基转移酶酶活力达218.32 U·mL-1,较优化前提高了4.63倍。在5 L发酵罐水平,重组P.pastoris FruSG在30%溶氧水平条件下诱导时果糖基转移酶的酶活力最高,可达到2294.70 U·m L-1,是摇瓶最高水平的10.51倍。(3)基于Swiss Model在线模拟软件对果糖基转移酶FruSG进行同源模拟,获得果糖基转移酶的三级(3-D)结构。通过结构分析,确定活性位点周围4个关键氨基酸位点C66、P65、I62、Q61,针对其进行定点突变获得12个突变体:C66A、C66T、C66N、C66S、P65A、P65S、I62A、I62S、I62M、Q61A、Q61Y、Q61W。较突变前的果糖基转移酶相比,突变体的催化效率常数kcat均提高。其中,突变体C66N的kcat提高最多,由突变前的63.33 s-1提高至1402.95 s-1。同时突变体C66N的比酶活也提高5.86倍,由突变前的2284.89 U·mg-1提高至15671.15 U·mg-1。(4)根据PoPMuSiC Web Server软件分析果糖基转移酶FruSG结构,获得9种可提高酶热稳定性的突变方式:E617F、S585F、D570Y、E543I、E508F、D336W、D311I、Q229I、Q159I。与突变前酶相比较,突变体Q159I、E617F、D336W的热稳定均提高。40℃保温2 h时,突变体Q159I、E617F、D336W酶活力残留分别为95.65%、79.52%、80.86%,分别提高至野生酶酶活力残留的1.34倍、1.12倍、1.14倍。其中,突变体Q159I在50℃时酶活力残留较野生酶提高了249.47倍。突变体Q159I在45℃时的半衰期(t1/2)也由野生酶的30.20 min提高至166.78 min。(5)采用6种不同连接肽将葡萄糖氧化酶和果糖基转移酶基因进行融合,在P.pastoris GS115中成功表达。测定不同重组酶催化蔗糖生产FOS的情况,结果发现重组酶Fru-GOD-D生产的FOS含量最高,达到48.06%,是野生酶产FOS含量的1.28倍。添加H2O2酶时,重组酶Fru-GOD-D生产的FOS含量达到89.96%,是野生酶产FOS含量的1.97倍。