肺炎克雷伯氏杆菌与大肠杆菌代谢调控及转录传感元件的研究

作     者：陈柳霓 

作者单位：北京化工大学 

学位级别：硕士

导师姓名：田平芳;阎春琦

授予年度：2016年

学科分类：07[理学] 08[工学] 09[农学] 071007[理学-遗传学] 090102[农学-作物遗传育种] 0710[理学-生物学] 1007[医学-药学(可授医学、理学学位)] 100705[医学-微生物与生化药学] 1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 100103[医学-病原生物学] 0901[农学-作物学] 0836[工学-生物工程] 10[医学] 

主      题：肺炎克雷伯氏杆菌 大肠杆菌 代谢调控 sigma因子 3-羟基丙酸 

摘      要：3-羟基丙酸(3-HP)为非手性有机酸,化学性质活跃,可转化为一系列重要化合物,且具有化学变通性。目前,商业化生产3-HP多为化学合成法,成本高、转化率低、分离纯化难度大,使得其生产方法亟待完善。微生物法产3-HP具有成本低和污染少等优势。随着合成生物学的发展,微生物生产3-HP引起人们关注。然而,微生物产3-HP的模式化生产仍然存在挑战。3-HP的研究需从多方面提高其产量和底物转化率,比如代谢调控、转录调控等。为此,本实验对肺炎克雷伯氏杆菌(Klebsiella pneumoniae)与大肠杆菌(Escherichia coli)的代谢调控及转录传感元件进行了研究。本实验设计与工作包括以下三方向内容：1.K. pneumoniae中转录传感元件与pk启动子相互作用的研究。考察了RNA聚合酶的σ因子与甘油脱水酶pk启动子的亲和性,旨在增强3-HP合成基因的转录表达,提高3-HP的产量。实验筛选了3个sigma因子rpoE、rpoS、dksA并对其进行超表达。引入卡那霉素抗性基因的启动子Pkana以排除甘油脱水酶自身的pk启动子对此3个因子超表达的干扰,采用绿色荧光蛋白基因(gfp)以验证表达量的强弱。结果发现,rpoE的表达增强了pk启动子的效率。于是将醛脱氢酶的基因ald4替换gfp,得到重组菌K. pneumoniae(pET-pk-ald4-pkana-rpoE)。酶活和SDS-PAGE分析发现,ald4的酶活所提高,SDS-PAGE中显示ald4的表达条带。摇瓶发酵结果显示,重组工程菌K. pneumoniae(pET-pk-ald4-pkana-rpoE)的3-HP产量是对照组K. pneumoniae(pET-pk-ald4)的1.6倍。上罐发酵结果表明,重组菌K. pneumoniae(pET-pk-ald4-pkana-rpoE)的3-HP和1,3-丙二醇(1,3-PD)的转化率分别为0.105 mol/mol和0.34 mol/mol,总转化率为0.445 mol/mol。3-HP和1,3-PD的产量得以显著提高。因此,rpoE和pk启动子的适配性更高,提高了pk启动子的转录效率,促进了后续基因的转录翻译。2. E. coli和K. pneumoniae的共培养研究。构建出携带不同抗性的***与E. coli,以辨别并探究两菌的混菌体系。因此,克隆了***中的cm基因,构建了重组工程菌E. coli(pET-cm)和K. pneumoniae(pET-28a)。E. coli(pET-cm)携带氯霉素和卡那霉素双重抗性,而K. pneumoniae(pET-28a)只携带卡那霉素抗性。考察了K. pneumoniae与E. coli单独培养和共培养的相对菌落数及存活率,结果显示,共培养中E. coli受到的生长抑制比K. pneumoniae更大,K. pneumoniae为共培养中的优势菌种。3.针对K. pneumoniae中3-HP代谢分向的研究。弱化K. pneumoniae中产3-HP的副产物途径,降低或消除其中一些副产物对3-HP的影响。本实验设计以提高3-HP的产量为前提,探究3-HP代谢流之间的相互关系。实验涉及K. pneumoniae甘油途径中的八个相关酶基因：pmd(KPN 01632)、poxB(KPN 00904)、frdB(KPN 04552)、fumC(KPN 01517)、 dhaT(KPN 03491)、ilvH(KPN 00083)、adhP(KPN 01853)和pflB(KPN 00931)。分别敲除了以上8个酶基因,弱化了八条代谢分支途径,构建了八株单基因敲除工程菌。对8株单基因敲除工程菌途径代谢物进行检测,分析单基因敲除工程菌中代谢流的变化,筛选出高产3-HP的工程菌。此外,对筛选出的最合适的两种酶基因进行组合敲除,测定组合敲除菌途径中代谢物的变化。在组合敲除菌中导入高产3-HP重组质粒tac-puuC,分析代谢物产量。由8株单基因敲除工程菌的摇瓶发酵结果可知,*** (△adhP)、K. pneumoniae(△pflB)的3-HP和1,3-PD相对产量较高,更适合做多基因敲除的表达宿主。由组合敲除菌的摇瓶和上罐发酵结果可知,K. pneumoniae △adhP△pflB (tac-puuC)在60 h时3-HP的产量达到了66.91 g/L,1,3-丙二醇的产量达到了3.85 g/L。此外,该重组菌K. pneumoniae △adhP△pflB (tac-puuC)的乳酸产量最高只为19.40 g/L,副产物的产量降低至对照组的1/3。该菌是生产3-HP的理想菌株。