斯氏假单胞菌A1501固氮岛中NifA依赖的未知功能基因转录特性研究

作     者：樊慧俐 

作者单位：中国农业科学院 

学位级别：硕士

导师姓名：陆伟

授予年度：2009年

学科分类：07[理学] 0713[理学-生态学] 

主      题：斯氏假单胞菌A1501 NifA 定点突变 基因表达 固氮酶活 

摘      要：斯氏假单胞菌A1501 （Pseudomonas stutzeri A1501）是分离自我国南方水稻根际的联合固氮微生物,该菌在微好氧和低铵的状态下具有明显的固氮活性。目前A1501菌全基因组测序和基因功能注释,不同氨、氧浓度条件下基因表达谱芯片分析工作已经完成。A1501菌基因组全长4567418 bp,编码4146个的开放阅读框（ORF）。基因组测序和基因芯片分析发现A1501的染色体上存在一个长度为49 kb,编码59个基因的固氮岛。在全基因组测序和芯片分析的基础上,为进一步探讨和研究A1501固氮基因的转录调控机制,本研究开展了正调控蛋白NifA一个关键位点的定点突变分析。同时也发现了“固氮岛内一些NifA依赖的未知功能基因,并对这些基因的功能进行了初步研究。 对NifA序列进行Blaster比对分析,发现该蛋白中间结构域C6区的一个酪氨酸残基高度保守（对应于A1501为Y370）。构建斯氏假单胞菌A1501野生型NifA及其Y370C突变体的表达载体,并分别与含PnifH+lacZ的融合表达载体共转化到大肠杆菌,β-半乳糖苷酶活性分析表明Y370C突变体不能激活nifH启动子,而野生型NifA可以激活PnifH+lacZ的表达。此外,NifA-Y370C不能使NifA缺失突变株A1506恢复固氮酶活,而野生型NifA可以恢复A1506的固氮酶活。研究结果表明斯氏假单胞菌A1501 NifA蛋白C6区的Tyr370氨基酸是NifA蛋白激活nif基因转录的关键位点,其具体作用机制值得进一步深入研究。 已有的芯片数据表明:斯氏假单胞菌A1501“固氮岛中几乎所有的基因在固氮条件下表达量比非固氮条件明显上调,其中包括16个未知功能基因。本工作着重研究了PST1305、PST1312、PST1325三个基因,选择这三个基因不仅因为它们在固氮条件下高表达,还在于PST1305与固氮基因nifBQ位于同一个转录单元,PST1312基因位于正负调控蛋白nifLA下游100bp处,PST1325位于固氮酶结构基因nifHDK的上游,以相反方向转录,而且该基因与其他固氮菌中nifHDK上游未知功能的基因相似性也很高。通过Real-Time PCR对这三个基因的转录表达进行分析,其验证结果与芯片分析结果一致。利用自杀性载体pK18mob,通过三亲结合和重组单交换,获得这三个基因的突变株。生长曲线测定显示这些基因的突变并不影响细胞的生长,但对固氮酶活的影响不尽相同。PST1305、PST1325突变株的固氮酶活分别为野生型的51.96%和24.27%,尽管这两个基因的确切功能还不清楚,但它们与A1501菌固氮酶活性的保持有着较大的相关性。而PST1312突变对固氮酶活影响不大。此外,我们确定了PST1305、PST1325基因的转录表达是受固氮正调控蛋白NifA调控的。