凡纳滨对虾与WSSV侵染相关的细胞与基因功能分析
作者单位：中国海洋大学
学位级别：硕士
导师姓名：邢婧;黄倢
授予年度：2014年
主 题：凡纳滨对虾 Runt转录因子 WSSV囊膜蛋白 组织细胞 内吞作用
摘 要：对虾白斑综合征病毒（WSSV）自20世纪90年代出现后，成为对虾暴发性流行病的主要病毒性病原，给水产养殖业造成巨大的经济损失。 WSSV是一种有囊膜病毒，其感染宿主细胞的第一步是囊膜与靶细胞膜的吸附，而后融合或者内吞进入细胞，完成对细胞的侵染，现已有多个蛋白被报道参与感染，但该病毒感染的分子机制尚不清晰，也没有有效的防治手段。本论文围绕解析WSSV感染宿主的分子机制为主要研究目的，分别从WSSV多个囊膜蛋白和凡纳滨对虾重要造血功能相关的转录因子Runt基因入手。通过荧光显微镜观察WSSV各囊膜蛋白是否能引起宿主细胞的内吞作用。并使用荧光微球技术，通过已知的受体蛋白对WSSV囊膜蛋白的细胞内吞抑制实验，进一步验证与WSSV感染相关的各蛋白之间的相互作用关系。同时研究凡纳滨对虾转录因子Runt在受到外界病原侵入后的表达变化，以及重组蛋白注入对虾体内对感染WSSV病毒后的相对保护情况。通过本论文的研究，以期为阐明WSSV的侵染机制及途径奠定基础。 本论文的主要研究内容包括以下五个部分： 1、WSSV囊膜蛋白介导细胞内吞实验：FITC标记的重组WSSV囊膜蛋白VP24，VP26，VP28，VP31和VP37介导凡纳滨对虾不同组织细胞的内吞作用鉴定。原代培养凡纳滨对虾的血淋巴，淋巴器官，上皮组织和造血组织细胞，在体外迁出后，和FITC标记的重组囊膜蛋白孵育，通过荧光显微镜观察发现，可以使血细胞发生内吞作用的有VP24，VP28，VP31和VP37;可以使淋巴器官细胞发生内吞作用的有VP28和VP37;可以使甲壳下表皮细胞发生内吞作用的有VP28，VP31和VP37;使造血组织细胞发生内吞作用的有VP24，VP28和VP37。综上所述，VP28和VP37均能单独介导宿主细胞发生内吞作用，在WSSV的侵染过程中发挥首要的入胞作用。 2、应用荧光微球技术研究凡纳滨对虾血淋巴细胞与偶联荧光微球的重组WSSV囊膜蛋白的相互作用，并探究AK，Rab7和BP53以及多克隆抗体对VP31，VP28和VP37进入细胞的影响作用。运用EDC法偶联荧光微球和重组囊膜蛋白，通过流式细胞术检测，结果显示BP53对VP37进入血细胞有抑制作用，而Rab7和AK对VP28和VP31进入血细胞没有起到抑制作用。VP28和VP37的多克隆抗体对VP28，VP37进入细胞有明显抑制作用，而对VP31抗体对VP31进入细胞没有抑制作用。说明血细胞对囊膜蛋白VP31的内吞存在非特异性。通过实验结果，我们可以推论，BP53作为VP37的受体在病毒侵染细胞过程中发挥重要作用，而Rab7可能作为一种细胞因子，与VP28相互结合参与信号转导并调节感染过程。 3、凡纳滨对虾Runt转录因子cDNA全长序列克隆：应用反转录和cDNA末端快速扩增（RACE）技术，首次在凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)中克隆并测序了一种Runt（lvrunt）基因全长。lvrunt cDNA全长1754bp，含有1个663bp长的开放阅读框，编码221个氨基酸，理论分子量为23.6kDa，具有Runt-family结构域。对该基因的蛋白序列分析显示，Lvrunt的氨基酸序列与软尾太平喇蛄（Pacifastacus leniusculus）相似度为88.1%，与其它种类的氨基酸序列相似性在30%—52.4%范围内，该蛋白表现较高的种间保守性。 4、lvrunt在凡纳滨对虾的组织表达特异性分析及注射对虾造血激素（LvAST）和WSSV对其转录表达的影响：对凡纳滨对虾鳃、肠、肝胰腺、类淋巴、心脏、肌肉组织和血淋巴lvrunt的转录特征进行分析，结果显示该基因几乎特异性地在血淋巴细胞中表达，而在其它组织中表达较低。肌肉注射重组蛋白rLvAST6h后，或白斑综合征病毒(WSSV)粗提液12h后均观察到lvrunt转录表达水平显著提高。 5、凡纳滨对虾Runt的原核表达及其对WSSV感染的体外中和实验：构建重组表达载体pBAD/gIIIA-lvrunt，转化到大肠杆菌***内，加入0.02%L-阿拉伯糖于37℃诱导表达，通过SDS-PAGE和对表达序列标签（6×His）的检测，鉴定得到重组目的蛋白，并经Co2+亲和层析纯化得到重组LvRunt蛋白。注射复性的重组蛋白于凡纳滨对虾或投喂给凡纳滨对虾小虾苗，再用WSSV攻毒，通过累计死亡率的计算，LvRunt并未对对虾起到保护作用。
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