精原干细胞调控相关细胞因子基因及标志抗原在猪性成熟前睾丸中表达的研究
作者单位：四川农业大学
学位级别：硕士
导师姓名：余树民
授予年度：2013年
主 题：猪 SSCs 标志抗原 相关细胞因子编码基因 转录水平 睾丸形态发育
摘 要：精原干细胞(spermatogonial stem cells, SSCs)是雄性哺乳动物精子发生的祖细胞,在研究雄性动物生殖发育、诱导多能干细胞及转基因动物生产方面有至关重要的作用。得益于标志抗原的发掘和相关细胞因子功能的深入研究,啮齿类动物和灵长类动物SSCs的鉴定和体外培养都获得了很大的进展,但是家畜SSCs的相关研究却较滞后。本试验以不同年龄段猪的睾丸做为研究对象,采用免疫荧光方法检测CSF1r和CSF1在猪睾丸中的表达,并对猪性成熟前睾丸内SSCs调控相关细胞因子基因的mRNA做半定量RT-PCR分析,还借助H&E染色和PGP9.5免疫荧光染色研究猪睾丸形态发育动力学。获得如下结果： 1CSF1及其受体CSF1r在猪睾丸中的表达 分别采集4日龄,3月龄大的猪睾丸组织,经石蜡切片,免疫荧光染色后,结果显示：CSF1r抗原在猪睾丸间质细胞表达,但不在管周肌样细胞表达,同时在4日龄猪睾丸曲细精管内性原细胞和3月龄精原细胞中也表达,4日龄CSF1r+性原细胞在管腔中呈散在单个分布,胞体大、核质比高,而3月龄CSF1r+细胞贴附于曲细精管基膜,CSF1r+呈单个或短链状分布,且数量较丰富。采用PLZF-CSF1r免疫荧光双标记,结果显示PLZF在部分CSF1r+细胞中表达,双阳性细胞在3月龄睾丸组织中贴曲细精管基膜单个分布,结果表明：曲细精管内表达CSF1r的阳性细胞部分表达PLZF,同时间质细胞也表达CSF1r。 以14日龄,3月龄,7月龄大的猪睾丸组织为材料进行免疫荧光染色,结果显示：CSF1在所分析的睾丸组织样品中均呈阳性表达,CSF1+细胞为睾丸间质细胞和管周肌样细胞。 2SSCs调控相关细胞因子基因在猪性成熟前睾丸中的转录表达 试验以4日龄、14日龄、1月龄、2月龄猪睾丸组织为材料,采用RT-PCR对性成熟前猪睾丸中GDNF, EGF, bFGF, CSF1、LIF进行转录表达分析。结果显示：所检测基因在各日龄段猪睾丸中均呈阳性表达;对表达的mRNA量的比较分析显示GDNF和bFGF的转录水平随日龄增加呈下降趋势,LIF转录水平随日龄增加呈上升趋势,EGF和CSF1的转录水平在各日龄段没有显著性差异。上述结果表明：SSCs调控相关细胞因子的基因在性成熟前不同日龄段猪睾丸中的表达均呈阳性,但是不同基因间转录水平的变化趋势存在差异。 3猪睾丸发育形态动力学的研究 以4日龄、7日龄、14日龄、1月龄、2月龄、3月龄、7月龄、淘汰老龄(old-sterile)猪睾丸为材料制作切片进行H&E和PGP9.5免疫荧光染色,结果显示： (1)4日龄睾丸间质区域中的细胞胞核形态多样,曲细精管周围明显有较多间充质细胞(间质细胞前体细胞)分布;4日龄到1月龄,曲细精管中的生殖细胞以性原细胞或精原细胞为主而初级精母细胞较少,2月龄～3月龄曲细精管中初级精母细胞的数目增多,到3月龄时已出现次级精母细胞,7月龄时,曲细精管中出现大量成熟的精子,淘汰老龄猪部分曲细精管中精母细胞的数量极少。 (2)采用ImageJ形态学分析软件对不同日龄猪睾丸各实质组织的相对面积和管径进行统计和测量,结果显示：3月龄之前,曲细精管相对面积和血管相对面积显著增加而间质部分相对面积显著减小,而1月龄前间质部分相对面积仍然占据优势部分,曲细精管管径没有显著增加,2月龄以后间质部分相对面积所占比例明显下降,曲细精管管径也呈现快速增大的趋势;7月龄与3月龄相比,曲细精管相对面积和间质部分相对面积差异都不显著,但曲细精管管径和血管相对面积显著增加。 (3)PGP9.5免疫荧光染色结果显示：2月龄前,PGP9.5+细胞在临近曲细精管基膜呈单个或者成对分布,荧光强度一致并呈强阳性,1月龄前PGP9.5+细胞数目变化不显著,2月龄与1月龄前相比PGP9.5+细胞数目显著增加,在基膜处见到强阳性的细胞集落;在3月龄,PGP9.5+细胞不仅出现在基膜,同时在管腔中央可看到阳性细胞集落,从基膜至管腔均有见到阳性细胞但是荧光强度逐渐减弱,与2月龄相比,阳性细胞数目显著增加;7月龄阳性细胞数量与3月龄相比没有显著变化,阳性细胞分布也与3月龄类似,相反,淘汰日龄猪PGP9.5+细胞数量明显减少。结果表明：PGP9.5+细胞数量从初生到3月龄持续增加,阳性细胞所处的位置与荧光强度在不同年龄段呈现一定差异。 综合以上结果,从出生到性成熟,睾丸中各种细胞的发育呈现出不同步性,1月龄前生殖细胞增殖缓慢、类型单一,主要发生体细胞的增殖和成熟,之后曲细精管管径逐渐增大,而且曲细精管内生殖细胞数量和层数也快速增加;PGP9.5在性原细胞和后续的精原细胞中表达,随着精原细胞的增殖,PGP9.5的表达强度呈现不均一性,荧光强度从基膜至管腔逐渐减弱
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