马流感病毒反向遗传系统的构建

作     者：王赠超 

作者单位：华南农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：李守军

授予年度：2016年

学科分类：090601[农学-基础兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题：马流感病毒 反向遗传系统 病毒拯救 

摘      要：马流行性感冒是由马流感病毒引起的马属动物的一种急性呼吸道传染病,世界动物卫生组织将马流感列为法定报告动物疫情之一。马流感的爆发曾对我国的养马业及赛马业造成沉重的经济打击,因此针对马流感病毒的基础研究一直是病毒学领域研究的重点。本研究以最早分离得到的H3N8亚型马流感毒株A/equine/Miami/1/1963(H3N8)为亲本,通过RNA抽提、反转录及PCR技术对流感病毒8条基因片段进行扩增,将扩增后的基因片段同pHW2000双向表达载体连接,最终得到了8个含有流感病毒不同基因片段的重组质粒,完成了马流感病毒反向遗传系统的构建。将构建好的重组质粒转染293T细胞,收获的细胞上清接种MDCK细胞继续进行培养,最终拯救出具有感染活性的病毒粒子rH3N8。对拯救出的rH3N8毒株进行基因序列测定,结果显示其各条基因片段的序列均与亲本毒株A/equine/Miami/1/1963(H3N8)相同。rH3N8毒株的血凝测定结果、TCID50测定结果及病毒生长曲线结果也均与亲本毒株相似。在构建好的马流感病毒反向遗传系统的基础上,以近年本实验室分离马流感毒株A/equine/Heilongjiang/SS1/2013(H3N8)为亲本,通过RNA抽提、反转录及PCR技术对毒株的聚合酶蛋白基因进行了扩增,连接pHW2000双向表达载体,使用构建好的质粒对A/equine/Miami/1/1963(H3N8)毒株的聚合酶蛋白基因NP、PA、PB1及PB2进行了替换,质粒转染细胞后拯救出了聚合酶蛋白替换重组病毒tH3N8。t H3N8毒株的测序结果显示其基因序列同质粒所携带序列相同。tH3N8毒株的血凝试验结果显示,其效价变化速率及同期血凝效价结果均高于rH3N8毒株。TCID50结果及病毒生长曲线结果也均反映出tH3N8毒株比rH3N8毒株在MDCK细胞上具有更快的病毒复制速度。上述结果暗示着A/equine/Heilongjiang/SS1/2013(H3N8)毒株的聚合酶蛋白相对A/equine/Miami/1/1963(H3N8)毒株在MDCK细胞上具有更高的适应性。本研究中反向遗传系统的成功构建及重组病毒的成功拯救,为之后马流感病毒的研究奠定了基础,同时也为马流感基因工程疫苗的筛选建立了平台。