Wnt/β-catenin信号途径和核心岩藻糖基化的交互作用在HEK293T细胞中的作用机制研究

作     者：郭笑寒 

作者单位：大连医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：张嘉宁

授予年度：2015年

学科分类：0710[理学-生物学] 07[理学] 08[工学] 09[农学] 071007[理学-遗传学] 0901[农学-作物学] 0836[工学-生物工程] 090102[农学-作物遗传育种] 

主      题：核心岩藻糖基转移酶 FUT8 Wnt/β-catenin 信号途径 HEK293T 细胞 

摘      要：岩藻糖基转移酶8(Fucosyltransferases 8,FUT8)又称为核心岩藻糖基转移酶,识别N-糖链与天冬酰胺相连的核心Glc NAc,将岩藻糖基从供体GDP-Fucose转移至此位置,形成?1,6糖苷键。岩藻糖基转移酶家族共有13个成员,而FUT8地位特殊,它识别位点单一,且没有功能冗余,对其进行研究具有重要意义。FUT8通过对靶蛋白的N-糖链进行修饰而影响其结构和功能,从而参与细胞内信号通路、细胞增殖、侵袭转移、细胞间粘附、免疫应答等过程。已有研究表明,FUT8在神经突触形成、老化等生理过程发挥重要作用;在肝癌、结肠癌、肺癌、慢阻肺、卵巢癌、肾纤维化、胃癌、胰腺癌、神经分裂等多种疾病中出现表达和活性异常,其靶蛋白AFP已经作为分子标志物,应用于肝癌临床诊断。Wnt信号通路在细胞增殖、分化、维持成体干细胞自我更新等生理过程发挥着重要作用,同时在肝癌、肺癌、结肠癌、直肠癌、毛囊癌等多种疾病中表出现过度激活。在目前已知的三条Wnt信号通路传导途径中,经典Wnt/β-catenin信号途径的研究最为透彻,本文在此基础上作进行研究。在肝癌、肺癌、结肠癌等多种疾病中,大量病例同时出现Wnt/β-catenin信号途径过度激活和FUT8表达异常,而此二者之间是否存在协同关系尚未明确。本实验利用HEK293T细胞,其Wnt信号通路处于正常状态,FUT8表达及活性处于正常水平;通过过表达相关蛋白,观察该信号通路和FUT8及核心岩藻糖基化的交互作用,并对其分子机制进行初步探索。实验方法:1)在HEK293T细胞中,通过过表达β-catenin、Wnt3a蛋白来激活Wnt信号通路,利用Western-blot和HPLC检测细胞内FUT8蛋白表达水平和催化活性;2)通过转染FUT8过表达质粒及其空载体,利用Western-blot、荧光素酶报告基因、细胞免疫荧光化学等实验,观察FUT8对Wnt/β-catenin信号途径的激活作用;利用平板克隆形成实验观察FUT8对细胞增殖能力的影响;3)利用蛋白合成抑制剂Cycloheximide和蛋白酶体抑制剂MG132,观察FUT8对β-catenin蛋白稳定性和细胞内整体泛素化水平的影响;利用免疫共沉淀、Lectin-blot、Western-blot等实验观察核心岩藻糖基化修饰对β-catenin蛋白的影响。实验结果:1)Western-blot和HPLC结果显示,在HEK293T细胞中,Wnt/β-catenin信号途径激活时,FUT8蛋白表达水平增高,催化活性增强;2)Western-blot结果显示,过表达外源性FUT8后,HEK293T细胞内Wnt/β-catenin信号途径主要分子β-catenin、Wnt3a、Dvl2蛋白含量增加,该通路靶基因表达上调;细胞免疫荧光化学、荧光素酶报告基因结果显示,过表达外源性FUT8促使β-catenin蛋白定位于细胞核,激活信号通路;同时,平板克隆形成实验结果显示,过表达FUT8可以增强HEK293T细胞活力,促进细胞增殖;3)Western-blot结果显示,过表达FUT8能够提高HEK293T细胞内β-catenin蛋白稳定性,降低细胞内蛋白泛素化修饰水平;免疫共沉淀及Lectin-blot结果显示,β-catenin或该通路其他分子可能作为FUT8靶蛋白发生核心岩藻糖基化修饰。实验结论:在HEK293T细胞中,激活Wnt/β-catenin信号途径可以上调FUT8蛋白表达水平和催化活性。过表达核心岩藻糖基转移酶FUT8可以激活Wnt/β-catenin信号途径,同时促进细胞增殖。上述现象可能的分子机制是FUT8过表达后导致Wnt/β-catenin信号途径中β-catenin或其他重要分子发生核心岩藻糖基化修饰,阻碍β-catenin发生磷酸化和泛素化修饰,抑制β-catenin经由蛋白酶体途径降解,导致其在细胞内累积,并由此激活Wnt/β-catenin信号途径。