TLR3/TRIF信号通路在帕金森病模型炎症反应中的作用及机制研究

作     者：杨明 

作者单位：成都医学院 

学位级别：硕士

导师姓名：李淑蓉

授予年度：2016年

学科分类：1002[医学-临床医学] 1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 100204[医学-神经病学] 10[医学] 

主      题：TLR3/TRIF信号通路 白藜芦醇 小胶质细胞 炎症表型 星形胶质细胞 多巴胺能神经元 

摘      要：帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是一种常见的中枢神经系统退行性疾病,该病主要病变特征是中脑黑质致密部(Substantia nigra pars compacta,SNpc)多巴胺(Dopamine,DA)能神经元死亡以及残存神经元内Lewy’s小体形成,最终引起纹状体内DA水平严重不足,出现一系列的临床症状。大量的体内外研究表明,炎症反应在帕金森病中发挥重要作用。尸体解剖、遗传学调查、回顾性研究和分子影像学诊断均提示炎症反应参与了PD的发生发展。患者尸检标本及MPTP诱导的PD动物模型的黑质-纹状体系统中均发现IL-1β及TNF-α等炎症因子的高表达。小胶质细胞是神经炎症反应的主要效应细胞,具有免疫监视、炎症调理和识别吞噬等功能,相当于脑和脊髓中的巨噬细胞。在神经炎症反应中,小胶质细胞活化具有异质性,可分为两个相对的M1(促炎)和M2(抗炎)表型。经典活化的M1型小胶质细胞,通过释放大量的炎症因子和氧自由基等,加重神经元的损伤;经替代激活途径活化的M2型小胶质细胞,可与M1型小胶质细胞相拮抗,抑制炎症反应,从而减轻神经元的损伤。Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)为一类保守的先天免疫受体。TLR3/TRIF信号通路的活化参与神经免疫炎症反应。在中枢神经系统,Toll样受体主要表达于具有免疫功能的胶质细胞中。其中,TLR3专一介导TRIF依赖信号通路,并且TLR3/TRIF信号的活化可能通过转化小胶质细胞M1/M2表型,进而参与PD的发生发展。目前,有关PD发生机制仍不清楚。毫无疑问,小胶质细胞M1/M2表型转换参与了PD的发生发展。然而,有关PD中小胶质细胞向不同表型转化的始动因素和机制目前仍不清楚,且相关研究缺乏。明确PD发生发展过程中小胶质细胞M1/M2表型转换机制将有助于深入认识PD的发病机制,进而有望为PD抗炎策略提供新的视角。因此,明确小胶质细胞M1与M2表型转换,是调控PD炎症反应亟待解决的关键问题。目的本研究通过构建pd动物模型,tlr3激动剂poly(i:c)以及白藜芦醇干预,旨在探讨tlr3/trif信号通路在小鼠pd模型炎症反应中的作用,以及白藜芦醇对mptp诱导的pd小鼠炎症反应过程中对tlr3/trif信号通路及中脑黑质炎症微环境的影响。方法第一部分:雄性c57bl/6小鼠,3-4月龄,体重20-25g,腹腔注射mptp(30mg/kg体重)建立亚急性pd动物损伤模型,并利用纹状体脑立体定位仪注射tlr3激动剂poly(i:c)。采用免疫组化th标记多巴胺神经元,cd11b标记小胶质细胞,gfap标记星形胶质细胞,分别观察三种细胞的形态学及数量改变。采用免疫组化检测tlr3和trif标记的蛋白在纹状体中的表达。采用实时荧光定量pcr技术检测中脑黑质tlr3/trif信号通路相关分子及小胶质细胞炎症表型标记物的mrna表达水平。本部分实验旨在探讨tlr3/trif信号通路在mptp小鼠pd模型炎症反应中的作用。第二部分实验:雄性c57bl/6小鼠,3-4月龄,体重20-25g,腹腔注射mptp(30mg/kg体重)建立亚急性pd动物损伤模型,以及腹腔注射白藜芦醇,采用免疫组化th标记多巴胺神经元,cd11b标记小胶质细胞,gfap标记星形胶质细胞,分别观察中脑黑质中多巴胺神经元的变化及小胶质细胞、星形胶质细胞的活化状态。采用实时荧光定量pcr技术检测中脑黑质相关炎症因子mrna的表达。探索白藜芦醇在mptp诱发的pd小鼠模型中对tlr3/trif信号通路及对pd发生发展密切相关的中脑黑质炎症微环境的影响。结果一、tlr3/trif信号通路在mptp小鼠pd模型炎症反应中的作用1.免疫组化结果显示,与对照组相比,mptp处理组小鼠中脑黑质部位可见th标记的多巴胺神经元数量减少,突触减少甚至消失。cd11b标记的小胶质细胞活化,胞体肥大,呈圆形或椭圆形,突起增多增粗,但相对静息状态时突起变短。gfpa标记的星形胶质细胞激活,细胞胞体肥大,呈梭形、线形、椭圆形或圆形,突起增多增粗变短。TLR3和TRIF标记的蛋白在胶质细胞中高表达。***实验结果表明,注射Poly(I:C)7天后TLR3/TRIF信号通路相关蛋白(TLR3,TRIF及IFN-?)mRNA表达显著增加;M1型小胶质细胞标记物TNF-α、IL-6、CD86、iNOS的mRNA表达量呈上升趋势;M2型小胶质细胞标记物IL-10、CD206、Arg1、YM1的mRNA表达量也呈上升趋势,但以M1型小胶质细胞标记物上升为主,注射Poly(I:C)14后以M2型小胶质细胞标记物上升为主。二、白藜芦醇在MPTP诱发PD小鼠模型中对TLR3/TRIF信号通路及中脑黑质炎症微环境的影响1.免疫组化结果