促红细胞生成素缓释微球对视神经挫伤大鼠视网膜神经节细胞长效保护作用的实验研究

作     者：荣先芳 

作者单位：复旦大学 

学位级别：硕士

导师姓名：莫晓芬

授予年度：2010年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100212[医学-眼科学] 10[医学] 

主      题：促红细胞生成素 缓释微球 视网膜神经节细胞 视神经挫伤 神经保护 

摘      要：视神经疾病等神经性慢性致盲性眼病,目前尚无有效的治疗方法,药物治疗仍是这些疾病的主要治疗手段之一。神经营养因子对视网膜神经细胞的保护作用的研究一直是眼科届研究的重点,由于眼球结构的特殊性,视网膜给药苦难重重,如何才能达到安全、持久、有效的视网膜给药治疗效果仍然是有待克服的难题。 近些年来,眼内蛋白缓释给药系统的开发和应用从一定程度上克服了传统给药方式（如全身给药、滴眼、局部注射等）药物难以到达眼内或难以达到持久、安全的药效的不足。 研究证明,促红细胞生成素（Erythropoietin, EPO）对视网膜神经节细胞、感光细胞、视网膜色素上皮细胞等均具有神经保护作用,且价格相对便宜,具有很好的临床应用前景。本研究就乳酸/羟基乙酸共聚物[Poly（L-lactic-co-glycolic acid）, PLGA]包裹的EPO缓释微球注射到SD大鼠视神经挫伤模型的玻璃体腔来探讨这种缓释系统对视网膜神经细胞保护作用的可行性及长效的视网膜神经保护作用。 第一部分促红细胞生成素缓释微球的制备和体外释放实验 目的制备装载EPO的PLGA缓释微球（EPO-PLGA微球）,并探讨其体外EPO释放曲线。 方法利用低温诱导相分离方法制备EPO多糖微粒,然后用水包油-油包固法（Solid-in-oil-in-water method, S/O/W法）制备EPO-PLGA缓释微球。ELISA法检测所制备的EPO-PLGA缓释微球EPO的释放曲线。 结果S/O/W法制备的EPO-PLGA缓释微球,表面光滑,粒径在40-100μm之间,体外释放第一天突释小于10%,缓释到第60天时,释放率可达80%以上,释放持久稳定,释放曲线接近线性释放。 结论S/O/W法制备的EPO-PLGA缓释微球可以达到EPO的长效线性缓释作用,为进一步探讨EPO-PLGA缓释微球的生物学药效提供了依据。 第二部分促红细胞生成素缓释微球体外活性和安全性的评估 目的探讨EPO-PLGA缓释微球的体外活性,并对PLGA及其降解产物安全性进行评估。 方法建立体外培养的大鼠视网膜组织三维立体培养系统,取1—3天新生SD大鼠视网膜,选取旁中心区视网膜,切成0.5mm×0.5mm大小植片,培养其中,分四组：EPO组,EPO-PLGA组,PLGA组和对照组,分别加入EPO （1 IU/mL）、EPO-PLGA释放液（含EPO 1 IU/mL）、空白PLGA释放液,对照组不加。在倒置相差显微镜下动态观察视网膜神经节细胞轴突生长情况,取培养第6天进行统计分析。 结果培养第6天后,从视网膜植片轴突再生的平均长度和密度来看,与对照组相比,EPO和EPO-PLGA释放液对视网膜神经节细胞轴突生长均有促进作用,具有显著统计学差异（p0.001）;而空白PLGA释放液组与对照组间无明显差别（p0.05）。 结论EPO-PLGA缓释微球在制备和释放过程中不影响EPO的生物学活性,且PLGA及其降解产物无明显的组织细胞毒副作用。 第三部分促红细胞生成素缓释微球对视神经挫伤大鼠视网膜神经节细胞-长效保护作用的实验研究 目的以视神经挫伤大鼠为模型,探讨促红细胞生成素缓释微球EPO-PLGA微球经玻璃体腔注射对受损视网膜神经节细胞的长效保护作用。 方法选取成年SD大鼠,分为五组：未治疗组,EPO组,EPO-PLGA组,PBS组和PLGA组。建立视神经挫伤模型。建模后,未治疗组不予玻璃体腔注射,EPO组分别于即刻和造模后4周玻璃体腔内注射EPO10IU （5μL）, EPO-PLGA组即刻给予玻璃体腔内注射EPO-PLGA缓释微球20mg （5μL,含EPO 20 IU）, PBS组分别于即刻和造模后4周给予玻璃体腔内注射0.01M PBS （5μL）, PLGA组即刻给予玻璃体腔内注射空白PLGA微球20mg（5μL）。分别术后4周和8周处死大鼠,处死前5天DiI上丘逆标视网膜神经节细胞（Reinal Ganglion Cells, RGCs）,视网膜铺片观察各组RGCs存活情况;视网膜切片TUNEL检测各组分别在术后1天、5天、2周、4周RGCs的凋亡情况;免疫组化检测各组分别在术后1天、5天、2周、4周视网膜神经胶质原纤维酸性蛋白（Glial Fibrilary Acid Protein, GFAP）的表达情况。 结果视网膜铺片RGCs计数显示,正常SD大鼠RGCs密度为2387.69±164.87（个/mm2）;术后4周,未治疗组、EPO组、EPO-PLGA组、PBS组和PLGA组RGCs密度（个/mm2）分别为748.30±58.81、1418.52±154.91、1296.68±157.55、804.43±86