斑马鱼中Wnt信号对神经丘特异表达基因Six2b的调控

作     者：葛玲玲 

作者单位：上海海洋大学 

学位级别：硕士

导师姓名：范纯新;宋佳坤

授予年度：2017年

学科分类：0710[理学-生物学] 07[理学] 08[工学] 09[农学] 071007[理学-遗传学] 0901[农学-作物学] 0836[工学-生物工程] 090102[农学-作物遗传育种] 

主      题：斑马鱼 神经丘 Six2b CRISPR/Cas9 Wnt信号通路 

摘      要：Six基因家族编码一类重要的转录因子。Six蛋白与Hox蛋白类似,都具有同源异型结构域。Six蛋白广泛参与多种器官的发育,尤其在鱼类侧线发育中发挥重要作用。从促进头部神经基板的形成和分化,到与Eya1协同激活Atoh1a促进毛细胞的分化,都离不开Six蛋白的参与。除此之外,Six家族成员在染色体上成簇排列,且在脊椎动物进化过程中极为保守。Six各亚家族成员的表达模式具有组织特异性,它们在胚胎中的表达与其在染色体上的排列呈现相关性(共线性),如Six1/2主要表达在侧线系统,Six3/6主要表达在眼部。目前Six1基因在头部神经基板中的研究以及对侧线发育的研究比较多,Six2与Six1和都属于so亚家族,Six2基因是否与Six1类似,也参与侧线系统的发育尚不清楚。Six基因的表达模式的精确调控对其功能的发挥是很重要的。Wnt信号通路在胚胎发育、细胞凋亡和神经系统发育等过程发挥重要作用,也参与头部神经基板,以及内耳和侧线系统的发育调控。目前,Six2b基因的表达是否也受到Wnt信号通路的调控也是我们关注的问题。我们实验室的189b转基因鱼是通过Tol2转座子介导的大规模增强子诱捕建立的转基因斑马鱼。我们发现:该转基因鱼的绿色荧光蛋白(EGFP)16hpf时在前侧线基板出现,19hpf时在后侧线基板表达,30hpf、48hpf时在听囊、嗅囊、腺垂体、鳃弓和神经丘处表达,且在正在迁移的侧线原基处表达。我们进一步通过荧光免疫组化实验发现,189b转基因鱼的EGFP在神经丘中的表达,与神经丘标记分子Claudinb的免疫荧光信号重合,进一步说明189b转基因斑马鱼的EGFP确实在神经丘中表达。我们又利用染色体步移技术鉴定出该189b转基因鱼的EGFP插入位点位于Six2b基因的上游。进一步通过原位杂交实验发现Six2b基因的表达模式和189b转基因斑马鱼的绿色荧光信号出现的时空模式完全一致,说明189b转基因斑马鱼的绿色荧光信号可反映Six2b基因的表达。因此,我们可以用189b转基因斑马鱼来研究Six1/2基因的表达调控。为研究Six1/2基因上游的调控信号,我们利用了Wnt信号的热激诱导表达系统,hsp:wnt8a-egfp和hsp:dkk1-egfp。Wnt8a是斑马鱼经典Wnt信号通路的正向信号蛋白,而Dkk1(Dickkopf1)是Wnt信号通路中重要的拮抗分子之一,能够特异地抑制经典Wnt信号通路。我们热激处理hsp:wnt8a-egfp和hsp:dkk1-egfp转基因斑马鱼胚胎,通过碱性磷酸酶染色、YO-PRO-1染色和毛细胞计数技术,我们发现热激诱导Wnt8a和DKK1的表达后,斑马鱼的侧线系统的神经丘不能正常形成,证明了Wnt信号通路在斑马鱼侧线系统的发育过程中发挥调控作用。我们将189b转基因斑马鱼与hsp:dkk1-egfp转基因斑马鱼进行杂交。在18-19hpf时热激杂交胚胎,在40hpf和48hpf神经丘中EGFP的表达显著下降。这表明189b转基因斑马鱼的EGPF的表达受Wnt信号通路的控制。我们又通过整体原位杂交技术进一步证实了热激诱导Wnt和Dkk1的表达后,Six2b和相关基因在斑马鱼神经丘中表达量发生变化。为了进一步研究Six2b基因对斑马鱼侧线系统早期发育的影响,利用技术敲除Six2b基因,采用显微注射技术将Cas9 mRNA和Six2b gRNA混合后对斑马鱼第一细胞期受精卵动物极进行注射,利用测序与比对、T7EI酶酶切方法成功检测到了Six2b基因的缺失。然后通过fluorescent PCR和毛细管电泳技术成功筛选出Six2b缺失的F1成鱼。缺失Six2b的F1斑马鱼可以用于后续关于侧线系统发育的研究。综上,我们建立了一个检测Six2基因表达的转基因斑马鱼系统;同时发现Wnt信号可调控Six2b基因在斑马鱼神经丘中的表达。这为进一步研究鱼类侧线发育和脊椎动物Six基因家族的表达调控奠定了基础。