人体MDM2蛋白的重组表达，纯化及鉴定研究

作     者：孟希 

作者单位：东华大学 

学位级别：硕士

导师姓名：陆昌瑞

授予年度：2016年

学科分类：0710[理学-生物学] 07[理学] 08[工学] 09[农学] 071007[理学-遗传学] 0901[农学-作物学] 0836[工学-生物工程] 090102[农学-作物遗传育种] 

主      题：MDM2 Zinc Finger RING 蛋白表达与纯化 单体鉴定 

摘      要：MDM2(Murine double minute 2)是RING(Really interesting new gene)型泛素蛋白连接酶的重要成员之一。它最主要的生理功能是负调控抑癌蛋白p53,通过与p53的直接结合抑制p53转录因子活性,促进p53泛素化修饰、降解及其出核移位过程。MDM2是p53最重要的抑制因子,通过多种分子机制调控p53的稳定性及生物功能,其过程及具体机制繁多且复杂。MDM2蛋白主要由N端到C端有四个功能区构成,其中氨基端的19-110氨基酸的I区可以使MDM2与p53基因紧密结合;200-280高度酸性区域的II区可以与核糖体15蛋白及5srRNA相互结合;300-330氨基酸区域的III区则含有一个锌指结构;438-491氨基酸的IV区包含一个环指结构,参与各种蛋白质之间的作用。MDM2既能通过与p53直接结合来抑制p53转录因子活性,同时也能利用其非p53依赖途径而发挥致癌作用。有研究显示,在p53缺失的条件下,mdm2的转基因小鼠也容易自发性形成肿瘤。在至少百分之七的肿瘤中,p53基因是正常的而mdm2基因却异常扩增。同时,在肿瘤及正常组织中,至少已鉴定出40多种不同的mdm2剪接体,而其中大多数剪接体都不含有p53结合区,表明MDM2癌基因活性的发挥另外存在某种不依赖于p53的其他途径。MDM2通过对一系列底物分子蛋白稳定性的调控作用,参与调节基因组的稳定性、细胞周期、细胞分化及DNA损伤修复等多种生物学过程。MDM2作为联系肿瘤发生与泛素蛋白酶体系统的重要蛋白,无疑是未来相关药物研发的富有前景的靶标之一。本论文利用大肠杆菌SUMO表达系统制备了人体MDM2蛋白,并对该蛋白进行了纯化和鉴定研究。我们发现一步纯化可使MDM2蛋白达到90%的纯度;我们在对MDM2鉴定的过程中发现,MDM2蛋白aa368-aa429的氨基酸序列中,其中六个磷酸化位点的突变对MDM2蛋白泛素化功能的发挥起到了重要的作用,但该突变对MDM2蛋白的表达却影响不大。MDM2蛋白C端结构域在其结构和功能上发挥着重要的作用。为了更好地研究MDM2蛋白及其结构域特性,我们创新性地将MDM2蛋白C端300-491位氨基酸(CTD,C Terminal Domain,包括Zinc Finger结构域和RING结构域)进行单独地重组构建,纯化和鉴定。利用大肠杆菌SUMO表达系统获得了大量的融合蛋白,并通过Ni-NTA亲和纯化和ULP1酶切获得纯化率为90%的CTD蛋白。目的蛋白接下来可通过硫酸铵沉淀大幅度提高纯化程度并保持稳定。离子交换显示CTD蛋白仍保留结合DNA的能力,因此,在细胞悬液中加入DNASE可有效去除DNA并提高亲和纯化步骤的蛋白产率。我们最后利用Superdex75型号的分子筛对目的蛋白进行鉴定,其蛋白洗脱峰位置对应的蛋白分子量大小在35-43 kDa之间,与其在SDS-PAGE上鉴定的分子量大小一致,说明我们表达的CTD蛋白是单体结构。最终CTD蛋白纯化率为95%,产量为2 mg/L。本论文创新重组表达了MDM2蛋白及其重要的CTD结构域,并找到了简捷高效纯化该目的蛋白的方法,为以后的结构及晶体研究打下坚实基础。之前的研究发现MDM2全长和其C端RING结构域本身会形成同源或异源二聚体,并且RING本身也难以纯化,因此,在本研究中,我们得到的CTD蛋白,通过将RING结构域与其上游结构域Zinc finger一起表达纯化而得到的单体结构,为MDM2非p53依赖途径的研究提供了新的思路。