对映—贝壳杉烷型二萜Leukamenin E诱导人宫颈癌细胞Hela的分化及骨架的重排

作     者：何苗 

作者单位：西北师范大学 

学位级别：硕士

导师姓名：丁兰

授予年度：2014年

学科分类：1006[医学-中西医结合] 10[医学] 100602[医学-中西医结合临床] 

主      题：对映-贝壳杉烷型二萜 Leukamenin E Hela细胞 分化 微丝 微管 角蛋白中间纤维 

摘      要：癌症是威胁人类健康的重大疾病之一，化疗和手术治疗是治疗癌症的主要手段。诱导肿瘤细胞分化成为新型的肿瘤治疗手段。与传统的肿瘤治疗方式相比，具有用药剂量小，毒副作用低等优势。 香茶菜属植物在我国分布广泛，种类繁多，其中有30多种作为民间药用植物;香茶菜属植物中对映-贝壳杉烷型二萜化合物的含量极为丰富，为主要次生代谢产物。据报道，它们均具有良好的抗肿瘤作用。目前，有关Leukamenin E诱导Hela细胞分化，Leukamenin E对人宫颈癌细胞Hela骨架的影响研究尚未见文献报道。 本文以对映-贝壳杉烷型二萜Leukamenin E(甘肃产拟缺香茶菜中分离得到)为受试药物，以人宫颈癌Hela细胞为受试对象。用台盼蓝排染法检测了该化合物对Hela细胞的生长抑制作用，并对该化合物对细胞周期的影响进行了研究;同时，利用平板集落形成，测定碱性磷酸酶、吉姆萨染色法研究Leukamenin E对Hela细胞的分化诱导情况;最后，利用间接免疫荧光和荧光染色法，观察该化合物对Hela细胞微丝、微管和角蛋白中间纤维骨架重组及含量的影响。主要结果如下： （1）台盼蓝排染法结果显示：Leukamenin E对Hela细胞有较明显的生长抑制作用，并且表现出浓度和时间依赖性。在同一时间，不同浓度下，随着浓度的升高，生长抑制作用逐渐增强。 （2）平板集落形成能力的检测：Leukamenin E对Hela细胞集落形成能力有明显抑制作用，并且在不同浓度之间存在显著差异。 （3）倒置显微镜观察细胞形态的变化：对照组细胞形态正常，无明显改变，排列密集，仅见少许漂浮的细胞。随着药物浓度的升高，细胞数量依次减少并呈现出时间和浓度依赖性，细胞排列稀疏，形状变的不规则，伸出长的不规则的突起，培养液中有许多漂浮的呈桑葚样细胞。 （4）吉姆萨染色法结果显示：Leukamenin E对细胞核形态有明显影响，细胞核形态类似肾形，同时，与对照相比，细胞核的体积变小，核浆比值下降，并且随着药物浓度的升高和时间的延长，此现象愈加越明显，同时胞质中出现可见的小空泡。 （5）流式细胞术检测结果显示：Leukamenin E对Hela细胞的周期有阻滞作用。在48h和72h后以G1期阻滞为主，S期细胞含量略有下降。 （6）活性氧的变化：随着Leukamenin E浓度的升高，细胞内活性氧(ROS)含量增加，说明活性氧增加是启动细胞分化的事件之一。 （7）碱性磷酸酶活性的变化：Hela细胞经不同浓度Leukamenin E处理之后，碱性磷酸酶活性显著升高，与对照组相比，存在显著差异。 （8）划痕法观察Hela细胞迁移的结果显示：Leukamenin E对Hela细胞的迁移有明显的抑制作用，且浓度越高，抑制作用越明显。在最高浓度时，细胞的迁移已经完全被抑制。 （9）罗丹明标记的鬼笔环肽对微丝染色结果显示：Leukamenin E对Hela细胞中微丝骨架具有解聚作用，并且具有浓度依赖性。对照组细胞胞质中应力纤维含量丰富，平行的应力纤维束排布杂乱。在较低浓度时，应力纤维的排布与对照相比变得整齐，成为平行的束状纤维，沿细胞纵轴平行排列。随着浓度的升高，应力纤维的分布变得不均匀，并且含量明显减少，在最高浓度时，应力纤维基本消失。 （10）免疫荧光技术观察微管骨架结果显示：Leukamenin E对Hela细胞中微管骨架在细胞中的排布有明显的影响。微管在对照组细胞中均匀分布，加药处理后，总体趋势是向核周聚集，并且时间越长，浓度越高，聚集现象越明显，在核周形成荧光强度较强的斑状区域，微管从核周开始，向四周发射。 （11）免疫荧光技术观察角蛋白中间纤维骨架结果显示：Leukamenin E对Hela细胞中角蛋白中间纤维骨架在细胞中的排布有明显的影响。角蛋白中间纤维在对照组细胞中均匀分布，在低浓度条件下，没有发生变化。在较高浓度条件下，角蛋白中间纤维在细胞中发生了重排，总体趋势是向核周聚集，并且时间越长，浓度越高，聚集现象越明显，在核周聚集形成荧光亮斑，角蛋白中间纤维从核周开始，向四周发射，明显发生了重排。 （12）流式细胞术检测细胞中三种骨架含量的结果显示：Leukamenin E对Hela细胞的三种骨架含量都有不同的影响。随着药物浓度的升高，微丝的含量明显减少，微管和角蛋白的含量增多。