表达PCV-2 Cap蛋白主要抗原位点基因重组PPV的构建及其免疫原性研究

作     者：代小芳 

作者单位：山东农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：谢之景

授予年度：2012年

学科分类：090603[农学-临床兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题：PPV PCV-2 序列分析 系统发生树 重组疫苗 

摘      要：猪细小病毒（Porcince parvovirus，PPV）是引起母猪繁殖障碍的主要病原体之一，以母猪发生流产、不孕、产死胎、木乃伊胎及弱仔等为特征。猪圆环病毒2型（PCV-2）为引起猪断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）的主要病原，并且PCV-2严重破坏猪的免疫系统，使猪的抵抗力下降，易发生混合或继发感染。在实际生产过程中，PPV和PCV-2常混合或继发感染，相互作用，加重疫病的发展，给生猪的繁殖、发展带来了巨大的经济损失。 本研究将猪细小病毒JT株（PPV-JT）同步接种PK-15，提取复制型DNA（RF-DNA），将其分段克隆至pUC18载体，最终构建得到PPV全基因组感染性克隆，命名为pPPV-JT，并进行测序分析。结果，PPV-JT株全基因长4941bp，与GenBank中发表的参考PPV毒株的相应基因序列进行比较，NS1基因的同源性为98.2%～99.9%;NS2基因的同源性为97.9%～100%;NS3基因的同源性为98.5%～100%;VP1基因的同源性为98.6%～99.9%;VP2基因的同源性为98.3%～99.8%。结果表明PPV基因具有相对较高的保守性。系统发生分析表明PPV-JT株的NS1基因与PPV China株的亲缘关系最近，NS2基因及NS3基因与PPV BQ株的亲缘关系最近，但结构蛋白VP1基因和VP2基因与NADL-2株的亲缘关系较为密切。系统发生树分析结果表明PPV-JT株可能是一株新的重组PPV。将PPV-JT株与其同源性最高的NADL-2株基因对比发现，NS1蛋白发生了Trp440Leu突变;VP2蛋白发生了Pro304Ser突变。其中VP2蛋白上的突变位于第4个线性化抗原位点上，可能会影响PPV的抗原性和致病性。PPV-JT NS1蛋白的Thr435和Ser473为其磷酸化位点。PPV-JT的VP2蛋白的378、383和436位氨基酸残基序列及两个127bp的重复序列都与NADL-2株一致，推测PPV-JT株为弱毒株。 因细小病毒的基因组小，易于体外操作，并能有效表达外源基因，所以用细小病毒为载体具有较大的优势。将pPPV-JT转染PK-15细胞，能够包装出PPV病毒粒子，经理化性质鉴定、特异性试验和PCR鉴定所获得的拯救病毒与原病毒的生物学特征一致，这为进一步构建以PPV为载体的重组病毒奠定了理论与物质基础。 用PCR的方法扩增得到PCV-2Cap蛋白的第276～450bp基因片段，包含ORF2的117～131AA线性化抗原表位，将其克隆至pPPV-JT的Nco I限制性酶切位点处，筛选正确的重组子，命名为pPPV-Cap。利用脂质体介导，将pPPV-Cap转染PK-15细胞，获得重组病毒，命名为PPV-Cap。采用RT-PCR与IFA方法对目的基因进行检测，结果表明，目的基因得到了正确的转录与表达。为检测PPV-Cap的免疫原性，将PPV-Cap免疫接种仔猪，采用ELISA方法检测免疫仔猪的抗PPV和PCV-2的体液免疫水平，结果表明PPV-Cap能够诱导仔猪产生抗PPV和PCV-2的免疫反应，为研究PPV-PCV2重组疫苗提供了实验数据。