慢生根瘤菌结瘤因子研究

作     者：侯卫国 

作者单位：南京师范大学 

学位级别：硕士

导师姓名：连宾

授予年度：2007年

学科分类：07[理学] 0713[理学-生态学] 

主      题：慢生根瘤菌 豆科植物 结瘤因子 遗传进化 田间试验 

摘      要：本文分析了结瘤基因的多样性及遗传方式，研究了慢生型大豆根瘤菌结瘤因子的诱导、提取和检测，并对结瘤因子及活性分子复合制剂进行了初步应用。 根瘤菌是一类与农业生产关系密切的细菌。结瘤因子(Nodulation Factor)是一类由根瘤菌分泌的信号分子，它们在结瘤的起始阶段和根瘤菌、豆科植物相互识别的过程中都发挥重要的作用。结瘤因子的结构为类脂壳寡聚糖(lipo-chitooligosaccharides，LCO)结构，其基本骨架是由3～5个β-1，4-糖苷键连接的乙酰氨基葡萄糖寡聚体，在非还原端酰胺基团脱乙酰基的氨基上连接一个C16～20的不饱和脂肪酸，同时还有一些基团被修饰如连接脂肪酸链的氨基甲基化和非还原端的羟基甲基化、酰基化，还原端的羟基磺酸化或连接上其它单糖。这些不同的结瘤因子是由基因调控合成的，与结瘤因子合成相关的基因称为结瘤基因，结瘤因子结构的多样化一定程度上显示了结瘤基因的多样化。结瘤因子对植物具有广泛的生理作用，如诱导皮层细胞分裂、根毛变形、质膜去极化、肌动蛋白纤丝重组、细胞质流动加速等变化。同时，结瘤因子对植物生长和种子萌发有促进作用，因此结瘤因子可以作为一种生长促进剂应用于农业生产中。 采用生物信息学的原理和方法对已经发表的慢生根瘤菌属的nodA基因的多样性和系统发育关系进行了分析，并将nodA的系统发育关系与其他nod基因及持家基因16S rDNA、dnaK的系统发育关系进行了比较。同时我们对结瘤因子进行了初步的应用研究，通过扩增并测序16S rDNA，首先对四株慢生根瘤菌进行了分子鉴定，然后用分别用染料木黄酮(genistein)和大豆根浸提液诱导结瘤因子，使用HPLC和结瘤因子诱导根毛变形两种方法检测了结瘤因子，最后用提纯的结瘤因子或和添加微量元素硼、钼的结瘤因子进行了田间试验。主要研究内容与结果如下： 1．四株根瘤菌经过16S rDNA扩增、测序、网上比对，并进行了基于16S rDNA系统发育分析。结果表明四株根瘤菌都为慢生根瘤菌属的细菌，系统发育分析显示慢生根瘤菌属代表一个复杂的属。 2．对慢生根瘤菌属的部分结瘤基因进行遗传和进化分析，比较了它们与持家基因进化树间的关系，结果表明慢生根瘤菌属的结瘤基因主要是通过直系遗传的，同时可能为适应宿主及环境条件，结瘤基因有少量的平行转移。 3．对慢生根瘤菌的进行培养、结瘤因子的诱导、以及结瘤因子检测，证明了染料木黄酮可以诱导慢生根瘤菌分泌结瘤因子，同时证实大豆的根浸提液是慢生根瘤菌结瘤因子的有效诱导物。两种诱导剂诱导同一株根瘤菌可以得到不同类型的结瘤因子，大豆根浸提液诱导的结瘤因子种类更为丰富。 4．田间试验使用约10M的结瘤因子喷洒于苗期大豆根部，同时设了一组元素与结瘤因子一起施用。结果表明单纯结瘤因子对豆科植物结瘤数、植株鲜重和干重、株高和大豆产量都有显著提高效果;与单独施用结瘤因子相比，微量元素硼和钼对大豆没有明显的促进作用。 本课题一方面探讨了慢生根瘤菌的结瘤基因的遗传方式，是对根瘤菌结瘤基因进化理论的一个补充。另一方面我们诱导检测了结瘤因子，使用一种廉价的大豆根浸提液作为诱导剂成功诱导结瘤因子，并用结瘤因子及其分子复合制剂进行了初步的应用研究，为结瘤因子在农业生产上的应用奠定了理论基础。